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질문 [최종입니다..] 이대로 FACS 진행해도 상관없을까요??
앞다리해브어굿타임(대학생)  |  04.09 17:48

실험실에서 제가 처음 해보는 거라 조언을 들을 수가 없어
요즘 질문이 많았습니다 ㅜㅜ

암세포주 대한 독소의 apoptosis 유도효과를 확인하기 위해서 FACS 실험을 하려고합니다.
(독소가 비싼 독소라 최대한 아껴서 사용해야 합니다..)

저희 실험실에는 FACS 기계가 없어서 학교 공실관에 가서 찍어야하는데
처음해보는 실험이라 sample 준비를 여러번 읽어도 헷갈리네요ㅜㅜ
(공실관에서 FACS 찍어주시는 선생님이 계셔서 제가 sample만 잘 준비한다면 문제는 없어 보입니다..)


일단 그룹을

Control - unstaining
            Annexin V
            PI
            Annexin V + PI
독소처리군(1개의 농도) - unstaining

                                 Annexin V
                                 PI
                                 Annexin V + PI

의 8개로 설정을 했습니다.

제가 생각하는 protocol은
1. 6-well plate의 모든 well에 cell seeding
2. 24시간 배양 후 suction을 통해 배지 제거 
3. 3개의 well에다가만 독소 30uL + 배지 2970uL 처리
   (Control의 경우 배지 3mL 처리)
4. 48시간 배양 후 cell harvest

------ 아래는 protocol ------

5. Ice-cold PBS 500μL 넣고, Pipetting
6. 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리
7. Cell pellet만 남기고, 상등액 제거
   (5~7 과정을 2회 반복)
8. 1X binding buffer 1mL 넣고, Pipetting
9. Cell suspension 100μL를 새로운 1.5mL microcentrifuge tube로 옮기기
10. Annexin V solution 5μL, PI solution 5μL 넣고, Inverting
11. 실온에 15분 동안 놔두기
12. 1X binding buffer 400μL 넣기
13. 아이스박스에 아이스팩을 넣고 1시간 내로 이동하여 Flow cytometry로 분석
     (FACS tube는 실험실에 가지고 있는 것이 부족할 꺼 같아 공실관꺼 사용하려고 합니다. 이동은 1.5mL       tube를 Lack에 꽂아서 할 생각이구요)

이렇게 하면 Control 3개, 독소처리군 3개를 얻게 되고
각각의 sample들에 대해 저렇게 염색을 한다면
총 64개의 tube가 되는 것이죠..

이대로 준비하면 3반복 data를 얻을 수 있을까요??
(굳이 control을 3개까지 준비할 필요가 있을까요??)


아니면 양성대조군으로 H2O2 같은거로 사전실험을 한 번 해보고 저렇게 진행해야 될까요??

요즘 저것 때문에 너무 스트레스 받습니다ㅜㅜ
annexin V/PI staining으로 FACS 찍어보신 분들이 이 글을 보신다면
수정할 사항이나 이렇게 진행해도 괜찮을 꺼 같다라고 꼭 말해주세요ㅜㅜ 

 

#annexin V/PI staining
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리아이스티  |  04.09 18:11  

annexin v/PI staining protocol은 kit에서 나온대로 하면 상관 없을 것 같습니다만 저도 지금 공부중이라..ㅠㅠ

그런데 처음하는 실험인데 너무 무리하는거 아닐까요. 

우선 비싼 독소 처리 안하고 대체 가능한 apoptosis 유발 시약 (eg. etoposide)을 써서 control 1개, apoptosis induced sample 1개로 실험하시는게 좋을 것 같은데요ㅎㅎ

그리고 facs 찍기전 혹시 실험실에 cell strainer가 있다면 fact tube로 샘플 옮길 때 strainer로 한 번 걸러주세요. facs 분석할 때 조금 수월해집니다. 크게 뭉친게 없으면 안하셔도 상관없습니다.

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