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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 protein 분리방법,,,,
뒷다리초보석사쌤(대학생)  | 04.09 13:25

안녕하세요... protein 두가지를 cleavage site로 연결 시켜 놓은 것을 enzyme로 digestion하여 두가지 protein을 분리 시키려고 합니다.


1번째 protein은 16kDa이고 2번째 protein은 7kDa이라서 10k filter를 이용하여 protein을 분리하려고 하였으나 weston결과를 보니 전혀 분리 되지 않았습니다.
상층액에 있던 solution을 회수하여 weston 같이 했는데 거기에 7kDa인 protein도 있더라구요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ


10k filter다음에는 30k라 선뜻 하지 못하고 있습니다. ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 고수님들 조언부탁드립니다.

 

어떻게 해야 yield 좋게 분리 할 수 있을까요??ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

#protein
 
#cleavage site
 
#enzyme
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.09 13:49  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

30K는 현재 실험에 사용하기 힘듭니다.

10K UF 실험을 어떻게 진행 했는지 방법을 자세히 알려 주시기 바랍니다. 

뒷다리초보석사쌤  |  04.10 13:46  

우선 digestion한 protein들이 500ul정도 있어서 10K filter에 넣어서 3000rpm에 30min돌려주었습니다. 이때 상당수가 다 빠져 나왔습니다.

 

그리고 위에 남아있는 용액을 회수하기 위해서 다시 20min을 돌려서 회수 하였습니다. 상당수 빠져나온 solution에 7kDa의 protein이 있어야 한다고 생각했지만 weston bolt해본 결과 band 조차 없었으며 오히려 10K에 거른후 위에 남아있던 solution에 더 많았습니다.

 

digetion한 것도 weston 결과 보니까 너무 잘 잘려있었습니다.

 

ㅠㅠㅠㅠㅠ 어디가 문제 일까요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  04.10 15:25  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 우선 digestion한 protein들이 500ul정도 있어서 10K filter에 넣어서 3000rpm에

30min돌려주었습니다. 이때 상당수가 다 빠져 나왔습니다.

: 이 단계는 문제가 없습니다.

2. 그리고 위에 남아있는 용액을 회수하기 위해서 다시 20min을 돌려서 회수

하였습니다.

: 1차 UF 할 때 넣은 용액을 완전히 제거하는 것은 불가능 하기 때문에

목표하는 부피까지 농축하고 다시 buffer를 넣어서 원심분리해야 합니다. 

3. 상당수 빠져나온 solution에 7kDa의 protein이 있어야 한다고 생각했지만

weston bolt해본 결과 band 조차 없었으며 오히려 10K에 거른후 위에 남아있던

solution에 더 많았습니다.

: 원심분리를 하고 나서는 위, 아래 용액을 우선 SDS-PAGE로 확인하는 것을

권장합니다.

fractionation이 어떤 비율로 되는지 확인을 한 후 UF 실험 방법을 최적화

해야 합니다.

UF는 한번 원심분리해서 분리하는 것이 아니라 500ul 정도 UF하려면 buffer

500ul로 최소 3번은 원심분리 해야 합니다.

위의 용액은 최종 부피 조절이 가능하지만 빠져나온 용액은 2ml 정도되기

때문에 빠져나온 용액은 3K로 농축하면 됩니다.

최종적으로는 우선 SDS-PAGE로 분리 정도를 확이 후 WBT 혹은 다음 단계

실험을 진행하는 것이 좋습니다.

혹시 SDS-PAGE로 확인한 것이 있으면 gel을 한번 볼수 있을까요? 

혹시 어느제품을 사용하나요?

현재 분자량이면 충분히 분리 가능한 분자량입니다.

뒷다리초보석사쌤  |  04.10 16:35  
첨부파일 파일첨부: 캡처.PNG (133 KB)
이미지 첨부파일

1차에서 빠져 나온 용액을 계속해서 농축시키라는 얘기일까요?

혹시 UF의 단계를 적어주실 수 있을까요? 글로만 보니까 잘 이해가 되지 않습니다. 어떤 부분에서 세번 더 농축시키라는 얘기 일까요?

 

제가 sds로 확인해 보았지만 1차로 밑에빠진 용액에서와 그 용액을 가지고 3K로 한번더 filter를 거치고 나서 위에 남아있는 용액을 가지고 내려보았지만 sds 상에서 band를 아예 확인 할 수 없었습니다. 그래서 weston까지 진행했지만 역시 결과는 나오지 않았습니다 ㅠㅠㅠㅠㅠ

 

amicon ultra 2mL 10K 와 500ul 3K 이용하였습니다.

 

대왕개구리SPEED  |  04.10 22:08  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

SDS-PAGE 사진을 보니 우선 전기영동 조건부터 최적화를 해야 합니다.

저분자 단백질도 현재 사진보다는 더 내려도 분리가 가능합니다.

uncut lane에 target band가 어떤건가요?

digestion lane의 band 양이 너무 적고, 10K, 3K lane의 band는 안보이네요.

전체적으로 실험이 잘못되었습니다.

1. SDS-PAGE gel을 적어도 2/3까지 내려서 band 확인이 원활하게 해야합니다.

현재는 BPB line과 너무 붙어 있습니다.

2. 10K UF 처리 방법

A. 시료 500ul를 filter tube에 넣고 1차 원심분리

B. 상층액을 50ul이하로 줄인 후 cut-off된 용액은 새 tube에 옮김

C. buffer 500ul를 filter tube에 넣고 천천히 피펫팅하여 농축되고 남아있는

용액과 균등하게 혼합.

D. 2차 원심분리

E. B-D 단계를 2회 더 진행

F. filter tube에 남아있는 50ul정도의 용액을 새 tube에 옮김

G. cut-off된 용액을 3K UF로 농축하여 50ul로 만들어 10K 농축액과 SDS-PAGE

로 확인.

뒷다리초보석사쌤  |  04.11 17:05  
Cut-off 된거는 그럼 제가 원하는 7kDa의 protein 일까요? 저는 7kDa의 protein을 최종적으로 회수하고싶은 것 입니다. 혹시 protein이 PBS에 녹아있다면 buffer를 PBS로 사용 해도 괜찮을까요?

B-D단계를 거칠때마다 cut-off된 용액을 새 tube에 옮기면 나중에 이들을 한번에 모아서 3K로 농충 시키라는 이야기 이신가요? 처음 해보는 실험이라 이해가 가지 않는 부분이 많네요 ,,

SDS PAGE gel 은 끝까지 내려서 확인 해볼 수 있도록 하겠습니다.
대왕개구리SPEED  |  04.11 17:42  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cut-off 해서 7kda가 필요하더라도 cut-off 효율을 확인해야 하기 때문에

16kda, 7kda 모두 전기영동 하는것이 좋습니다.

cut-off된 용액 부피는 초기 시료 500ul와 500ul buffer change x 3회 = 1.5ml

따라서 약 2ml의 cut-off 용액을 한개의 tube에 모아서 균등하게 혼합한 후

3kda UF로 50ul가 남도록 원심분리하면 됩니다.

PBS로 실험했다면 PBS로 계속 실험하면 됩니다.

뒷다리초보석사쌤  |  04.13 12:16  

제가 이해한 방법을 적어보겠습니다. 혹시 검토 해주실 수 있을까요?

제가 갖고 있는 proten(16) - protein(7)이 24kDa인데 최종적으로는 7kDa만 회수 하여 이 protein의 양을 알고자합니다.

그래서  proten(16) - protein(7)이 24kDa을 여러개의 tube로 나누어서 enzyme digestion한 후 tube의 용액을 모아서 protein의 크기로 나눠 질 수 있다고 생각되어 2mL-10K filter를 이용하려고 합니다.

우선 enzyme digestion한 후 tube에 모은 protein들을 10K에 한번 걸러줍니다. 그렇다면 7kDa의 protein이 cut-off 되어서 2mL-10k filter 밑으로 나온 용액이라고 생각되기 때문에 이 용액을 새tube에 옮겨 놓습니다.

위에 남은 용액을 바로 제거 하지 않고 PBS 500ul씩 (1.5mL을 기준으로 3번 반복예정) 넣고 다시 cfg하고 밑에 떨어진 용액을 또 새 tube에 담습니다. 

tube에 담아둔 용액을 모아서 균등하게 섞은 후 500ul - 3K filter에 걸러주며 밑에 빠져 나온 용액은 버리고 다시 500ul 의 용액을 넣는 방법으로 농축을 시킨후 마지막에 filter위에 있는 용액을 다시 회수한다.

 

위와 같은 방법이 설명해주신 방법이 맞을까요?

 

그렇다면 얼마나 농축된건지 알 수 있을까요?

최종ul를 어떻게 50ul로 맞출 수 있을까요?

 

혹시 왜 PBS를 3번이나 더 추가적으로 넣어줘야 하는지 알 수 있을까요?

대왕개구리SPEED  |  04.13 13:53  

실험은 protocol 따라 하는 것도 중요하지만 protocol을 이해하기 위해 여러

방법으로 찾아보고 공부하는 것도 중요합니다.

 

- 위와 같은 방법이 설명해주신 방법이 맞을까요?

: 네..

- 그렇다면 얼마나 농축된건지 알 수 있을까요?

: 계산해 보면 알수 있습니다. 

- 최종ul를 어떻게 50ul로 맞출 수 있을까요?

: 원심분리해서 filter tube에 50ul만 남기면 됩니다.

- 혹시 왜 PBS를 3번이나 더 추가적으로 넣어줘야 하는지 알 수 있을까요?

: 원하는 fraction만 모으기 위해서 입니다.

예로 16 + 7이 혼합된 용액을 한번만 원심분리해서 7을 cut-off 시킬수 있으면

buffer washing을 할 필요가 없습니다.

불가능 하기 때문에 계속 buffer를 채워서 cut-off를 해야지 7kda가 단계적

희석되어 빠져 나갑니다.

 

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