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질문 FACS sample 준비로 스트레스입니다.
앞다리해브어굿타임(대학생)  |  04.08 17:15

apoptosis를 확인하기 위해 처리할 Sample의 양이 한정되다보니

처리할 sample을 최대한 아끼기 위해서는

Sample을 6-well에다가 어떻게 준비하는 것이 좋을까요??

적어도 신뢰성 있는 data를 얻으려면

FACS를 3개의 sample로 찍어야 되긴 할텐데요..

Sample setting이 너무 스트레스네요..

다행히, 처리농도는 제일 고농도 하나로만 칠꺼라 그나마 다행이네요..

 

하루안으로 한 번에 data를 얻으려면

upload_image

이렇게 한 번만 FACS를 찍는게 좋을까요??

물론 각각 Sample마다 

unstained, Annexin V single stained, PI single staind, Annexin V+PI stained

이렇게 4개씩 Sample을 모아두고요..

총 apoptosis kit를 24 test 분량 사용하는거구요..

#annexin V/PI staining
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리아이스티  |  04.08 18:11  

저는 HeLa cell을 이용해서 Facs analysis 하는데 1 well만으로 facs 한 번 찍기는 부족합니다. 3well은 합쳐야  facs tube 한개로 만들기 충분합니다..

PI staining하는거보면 cell cycle까지 보는건데 그러면 cell collect 당시 cell confluency가 중요합니다. collect 당시 ~60% confluency가 되도록하는게 좋고, facs 분석할때는 3x10^5~1x10^6세포가 필요합니다. 

앞다리해브어굿타임  |  04.09 09:05  

[아이스티]님 답변 감사합니다..

 

그런데, 저는 그냥 apoptosis랑 necrosis만 보려고 하고,

apoptosis protocol 보면 cell 양은 맨 처음 1~5x10^6 cells/mL를 얻은 다음

1~5x10^5 cells/100uL를 사용하고

염색을 다 하면 sample 총량이 500uL가 되는데도 부족할까요??

제가 직접 하는거면 sample 양에 문제 있겠지만

전문가에게 의뢰하는 거라서요..

 

그리고 seeding할 양만 잘 계산하신다면

3x10^5~1x10^6 cells/mL 정도는 쉽게 얻어지지 않나요??

개구리아이스티  |  04.09 18:27  

Facs 찍을 때 cell을 보통 1x10^5개면 신뢰하기 충분하다고 생각하는데. 1x10^5cell/500ul로 준비해가면 이걸 detection하는데 몇분이 걸립니다..세포만 충분히 많다면 1x10^5개 찍는데 20초만에 찍을 수 있어서

그렇기 때문에 적어도 3x10^5은 필요하다고 말씀드리는겁니다. 여유만 있다면 1x10^6까지 준비하는게 facs 찍을 때 편합니다ㅎㅎ

 

저는 cell cycle 확인하기 위한 목적으로 facs를 보기 때문에 cell harvest 당시 confluency가 ~60%가 되도록하는데 그러면 1well만으로는 세포가 부족하더라구요. 만약 그런게 상관이 없어서 harvest하는 당시 세포가 confluent하다면 경우에 따라 1 well로도 가능할 것 같습니다.

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