[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
라이카써머캠프
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 399  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 exosome에서 western 통해서 marker랑 protein 수준 확인하려고 하는데 trouble shooting을 도와주실 수 있나요 ㅠ
알펭숨(대학원생)  | 04.08 10:43

안녕하세요 exosome 관련 연구를 하려고 하는데, 제가 있는 방에서는 세팅이 되어 있지 않아서 부딪히면서 하고 있습니다. 

일단은 exosome 상에서 protein 이랑 CD9, CD63 같은 marker 확인하려고 western을 하려고 하는데요. 

exosome은 exoquick으로 뽑고, 뽑은 pellet을 RIPA buffer 이용해서 protein 추출을 했습니다. BCA assay 했을 때 농도도 적당히 잘 나오는데요.. 

 

western은 

10% gel에서 60V 30분, 80V 1시간 정도로 running하고 

PVDF membrane 이용해서 100V 1시간 정도 transfer 합니다. 

1차 항체는 4도 o/n / washing 5분씩 3번  

2차 항체는 RT 1시간 / washig 5분씩 3번 

ECL은 1:1로 섞어서 디벨롭

이렇게 진행하고 있어요 

 

폰슈에 담가 보면, 같은 조건에서 같이 내린 cell에서 분리한 protein 같은 경우에는 위부터 아래까지 다 예쁘게 잘 보이고 잘 찍히기도 합니다 .

그런데 exosome에서 분리한 protein 같은 경우에는 폰슈를 담가도 60kb 아래로는 없기도 하고.. 그 아래 부분에 보통 다 marker 항체가 있어서 붙여도 안 찍힙니다.. 너무 작아서 넘어갔나 싶어서 80V로 좀 낮추어서 했는데도 비슷하네요.. 

항체 문제일까 싶어서 1차 항체도 새로 풀어 보고 2차 항체도 바꾸어 봤는데 뭐가 문제일까요.. 

 

항상 touble shooting이 어려운 웨스턴입니다.. ㅠㅠ 고수님들 도와주신다면 정말 감사하겠습니다. 

#exosome
 
#western
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.08 11:34  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

우선 SDS-PAGE에서 CBB 염색으로 band pattern을 확인을 해보세요.

전체 band pattern을 알아야지 transfer문제인지 확인가능합니다.

transfer 문제인지 확인 후 이후 단계를 점검하는 것이 좋을 듯합니다.

jun920709@gmail.com  |  07.13 13:03   

안녕하세요! 혹시 문제 해결하셨나요?? 저도 같은 상황을 겪고 있는데,, 최근에는 kit를 써도 배지양을 많이 써야 나온다는 소릴 들은거같아서요.. 혹시 보신다면 꼭 댓글 부탁드려요!ㅠㅠ

답변하기
할인행사 광고 검색광고
다온비에스 다온비에스
[DNAGenotek] Oragene Collection kit 무료샘플 사용해보세요!! (7.31까지)
다온비에스 다온비에스
[DNAGenotek] Omnigene·GUT Collection Kit 무료샘플 사용해보세요!! (7.31까지)
브래디 브래디
초저온라벨 등 실험실용 풀칼라프린터 (COVID-19 안전사인 지원) (8.30까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
COVID-19 나노스트링 / NEB sequenicng and COVID-19 / Myra / Denovi.. (12.24까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
[TECAN] Reading과 형광 Imaging을 하나의 장비로 한 번에!! [Multi-mode micr.. (8.31까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
[에펜도르프코리아] Eppendorf 2020 상반기 프로모션 안내 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR.. (8.8까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
4/6  좌우
6,000
66,50063,200
370,000
482,000
125,500119,300
468,000
109,000
136,000129,200
339,400322,500
773,000734,400
139,000132,100
493,000
79,50075,600
482,000
739,000702,100
49,000
143,800136,700
93,20088,600
52,60050,000
47,20044,900
23,000
130,500124,000
17,000
92,30087,700
최근등록   더보기 >
초록색 색소의 흡광도 파장 스캔   07.13
s.cerevisiae 발효 배지   07.13
ELISA Ab 질문이요!!!!   07.13
3T3-L1 세포에서 지방산 β-oxidation 관련 효소(ACOX1, LCAD, MCA...   07.13
10x running buffer, 10x trans buffer 조성   07.13
안녕하세요.. antibody관련해서 질문드립니다..   07.13
BSA를 mouse에 immunization 시켰을때??   07.13
Real time PCR 결과계산 중 간단한 질문이 하나 있습니다.   07.13
16S rRNA DNA Similarity   07.13
hapten conjugation(BSA)   07.12
IDT Korea
제품평가
[비아이코퍼레이션]
e브릭몰(연구용 제품 온라인 구매 사이트)
비아이코퍼레이션
모집인원: 50명
모집기간: ~7/15까지
신청조건: BRIC 회원
평가자 혜택

- 참가자 전원 3만원 상품권 제공

제품평가자 모집중
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크