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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 exosome에서 western 통해서 marker랑 protein 수준 확인하려고 하는데 trouble shooting을 도와주실 수 있나요 ㅠ
알펭숨(대학원생)  | 2020.04.08 10:43

안녕하세요 exosome 관련 연구를 하려고 하는데, 제가 있는 방에서는 세팅이 되어 있지 않아서 부딪히면서 하고 있습니다. 

일단은 exosome 상에서 protein 이랑 CD9, CD63 같은 marker 확인하려고 western을 하려고 하는데요. 

exosome은 exoquick으로 뽑고, 뽑은 pellet을 RIPA buffer 이용해서 protein 추출을 했습니다. BCA assay 했을 때 농도도 적당히 잘 나오는데요.. 

 

western은 

10% gel에서 60V 30분, 80V 1시간 정도로 running하고 

PVDF membrane 이용해서 100V 1시간 정도 transfer 합니다. 

1차 항체는 4도 o/n / washing 5분씩 3번  

2차 항체는 RT 1시간 / washig 5분씩 3번 

ECL은 1:1로 섞어서 디벨롭

이렇게 진행하고 있어요 

 

폰슈에 담가 보면, 같은 조건에서 같이 내린 cell에서 분리한 protein 같은 경우에는 위부터 아래까지 다 예쁘게 잘 보이고 잘 찍히기도 합니다 .

그런데 exosome에서 분리한 protein 같은 경우에는 폰슈를 담가도 60kb 아래로는 없기도 하고.. 그 아래 부분에 보통 다 marker 항체가 있어서 붙여도 안 찍힙니다.. 너무 작아서 넘어갔나 싶어서 80V로 좀 낮추어서 했는데도 비슷하네요.. 

항체 문제일까 싶어서 1차 항체도 새로 풀어 보고 2차 항체도 바꾸어 봤는데 뭐가 문제일까요.. 

 

항상 touble shooting이 어려운 웨스턴입니다.. ㅠㅠ 고수님들 도와주신다면 정말 감사하겠습니다. 

#exosome
 
#western
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2020.04.08   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

우선 SDS-PAGE에서 CBB 염색으로 band pattern을 확인을 해보세요.

전체 band pattern을 알아야지 transfer문제인지 확인가능합니다.

transfer 문제인지 확인 후 이후 단계를 점검하는 것이 좋을 듯합니다.

jun920709@gmail.com  |  2020.07.13    

안녕하세요! 혹시 문제 해결하셨나요?? 저도 같은 상황을 겪고 있는데,, 최근에는 kit를 써도 배지양을 많이 써야 나온다는 소릴 들은거같아서요.. 혹시 보신다면 꼭 댓글 부탁드려요!ㅠㅠ

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