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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 DNA의 blunt-end 끝에도 p가 있나요 ?
알버그기(대학생)  |  04.06 10:48

안녕하세요...!

너무너무 기본적이고 부족한 질문입니다만 본질적인 문제가 해결이 안되어 선배님들께 조언을 구합니다..

제가 double strand의 oligo를 제작하여 PCR product의 양 끝에 붙이고 싶은데 수개월째 잘 되지 않습니다.

cDNA를 합성한 후 제작한 dsDNA linker를 양 끝에 붙이는 작업인데요,

처음엔 선배들이 시키는대로 linker를 주문했는데 전혀 안돼서 두가닥의 5'끝에 p를 붙여 합성한 것으로도 진행해봤지만 여전히 안됩니다.

1. DNA의 양 말단에 p가 있어야 ligation이 되는것 맞나요?

2. 제가 알기로 두가닥 중 한가닥의 말단에만 p가 있어도 ligation이 되는 것 같은데 맞나요...? 일반적으로 restriction enzyme을 처리해서 sticky end를 만들어도 한가닥만 p가 노출되는 것 같은데 말이죠..

3. 일반적인 reverse transcriptase를 사용하여 합성한 cDNA의 양 끝에는 p가 없겠죠?

ligase는 T4 ligase를 사용하고 있습니다.

이러한 점 외에 cloning이 안되는 이유가 있다면 선배님들의 귀한 고견 부탁드립니다. 정말 감사합니다!

 

#cloning
 
#ligation
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  04.06 13:37  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. DNA의 양 말단에 p가 있어야 ligation이 되는것 맞나요?

2. 제가 알기로 두가닥 중 한가닥의 말단에만 p가 있어도 ligation이 되는 것 같은데 맞나요...? 일반적으로 restriction enzyme을 처리해서 sticky end를 만들어도 한가닥만 p가 노출되는 것 같은데 말이죠..

3. 일반적인 reverse transcriptase를 사용하여 합성한 cDNA의 양 끝에는 p가 없겠죠?

만일 RT에 사용하는 oligo-dT의 5'에 P 가 붙어 있는 것을 사용하면 그곳에는 P 가 있으므로 ligation은 됩니다,

cDNA 에서 dsDNA를 만들때도 마찬가지로 P 가 붙은 oligomer를 사용하면 cloning은 가능합니다.

알버그기  |  04.06 14:51  

강시님 답변 감사합니다.

그럼 현재 저처럼 dsDNA linker와 p가 없는 cDNA를 붙이고 싶은 경우,  dsDNA linker 제작 시 5' 말단에 p를 붙여서 합성한 후 T4 ligase로 연결하면 될까요?

아니면 5', 3' 모두 p를 붙인 linker를 사용해야 할까요?

아니면 말씀하신대로 phosphate가 있는 oligo-dT를 사용해야 하는걸까요? ㅠㅠ (현재 저희는 random hexamer를 사용하고 있습니다.)

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