실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
DNA의 blunt-end 끝에도 p가 있나요 ?
레벨2 버그기 (대학생)
안녕하세요...!
너무너무 기본적이고 부족한 질문입니다만 본질적인 문제가 해결이 안되어 선배님들께 조언을 구합니다..
제가 double strand의 oligo를 제작하여 PCR product의 양 끝에 붙이고 싶은데 수개월째 잘 되지 않습니다.
cDNA를 합성한 후 제작한 dsDNA linker를 양 끝에 붙이는 작업인데요,
처음엔 선배들이 시키는대로 linker를 주문했는데 전혀 안돼서 두가닥의 5'끝에 p를 붙여 합성한 것으로도 진행해봤지만 여전히 안됩니다.
1. DNA의 양 말단에 p가 있어야 ligation이 되는것 맞나요?
2. 제가 알기로 두가닥 중 한가닥의 말단에만 p가 있어도 ligation이 되는 것 같은데 맞나요...? 일반적으로 restriction enzyme을 처리해서 sticky end를 만들어도 한가닥만 p가 노출되는 것 같은데 말이죠..
3. 일반적인 reverse transcriptase를 사용하여 합성한 cDNA의 양 끝에는 p가 없겠죠?
ligase는 T4 ligase를 사용하고 있습니다.
이러한 점 외에 cloning이 안되는 이유가 있다면 선배님들의 귀한 고견 부탁드립니다. 정말 감사합니다!
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