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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR smearing 현상ㅠㅠ
올챙이비수(대학원생)  |  04.03 18:40

안녕하세요.

요즘 PCR 수행시 smearing 현상 때문에 고생하고 있습니다!

세균 16S 영역을 증폭 중인데, 계속해서 smearing 현상이 발생하네요..

원인을 찾아보려고 노력중이지만 아직까지 소득이 없네요..

Template 문제일까봐 균도 새로 배양해서 DNA를 뽑았는대도 안되고,

Template 양이 문제일까봐 양도 줄여서 해봤는데 안되네요..

DNA 추출은 boiling methods로 뽑고 있는습니다!

이때까지 잘되다가 최근에 갑자기 안되서 annealing 온도 문제는 아닌거 같은데, 혹시 primer에 문제가 생기는 경우도 smearing 현상이 발생하나요?

primer는 아직 새 제품을 사용하지 않았는데, 혹시 조언을 해주실뿐 있으신가요ㅠㅠ

 

#PCR
 
#Smearing
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.03 18:50  

비특이 band가 나오는 수준이 아니라 전체적으로 smear하게 나오면 primer가

분해되어서 그런것 같습니다.

또한 잘되다가 갑자기 이런 현상이 나타나면 더더욱 primer 문제가 의심되며

새로운 primer로 PCR하면 정상적으로 나올겁니다.

올챙이비수  |  04.06 16:08  

새 프라이머로 진행했는데, 아직도 smearing 현상이 나타납니다ㅠㅠ

골치아프네요...

대왕개구리SPEED  |  04.06 16:13  

전기영동은 gel을 보는것이 해결하기에 도움이 됩니다.

새 primer로 smear하게 나오는 것이 primer 바꾸기 전과 pattern이 조금도 변하지

않았나요?

새 primer라는 것이 새로 주문한 primer인가요?

DNA를 standard method와 boiling method로 분리하여 비교를 한번 해보세요.

DNA 양은 10ng 이하로 사용하세요.

올챙이비수  |  04.07 16:16  
첨부파일 파일첨부: Gel.tif (144 KB)

첫번째와 마지막은 1kb ladder입니다.

2, 3번째는 kit를 이용하여 DNA를 추출했습니다.

4, 5번째는 boiling method로 추출했습니다.

2, 4번째는 기존에 사용하던 프라이머를 사용했고,

3, 5번째는 프라이머를 구입한뒤 DW를 넣지 않은 상태에서 상온 보관했던 제품인데, 이번에 DW를 넣은 프라이머입니다.

 

대왕개구리SPEED  |  04.07 16:38  

template DNA는 어디에 녹아있나요?

PCR 시 tube 당 얼마나 사용하나요?

올챙이비수  |  04.07 16:49  

Template DNA들은 TE버퍼에 녹아있습니다!

문제가 발생한 이후 TE버퍼에 DNase 오염이 발생했나 싶어서

새로 멸균하여 사용했지만 결과는 똑같았습니다!

그리고 PCR 수행시 template는 보통 2ul 넣고 PCR을 수행합니다.

template의 양이 문제인가 싶어 2ul와 1ul를 비교하여 진행했지만

역시나 동일한 결과였습니다ㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  04.07 17:34  
template DNA는 ul로 넣는것이 아니라 DNA양으로 넣어야 합니다.
현재 사용하는 DNA를 전기영동해 봤나요? 그리고 DNA양이 얼마나 되나요?
올챙이비수  |  04.07 17:41  

DNA양은 어떻게 알 수 있나요?

나노드랍으로 측정해야 하나요?

아직 template로 사용하는 DNA를 전기영동 해보지는 않았습니다!

 

대왕개구리SPEED  |  04.07 19:15  

전기영동으로 한번 확인해 보는것이 좋을 듯 하며

DNA양은 A260에서 측정하면됩니다.

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