비특이 band가 나오는 수준이 아니라 전체적으로 smear하게 나오면 primer가
분해되어서 그런것 같습니다.
또한 잘되다가 갑자기 이런 현상이 나타나면 더더욱 primer 문제가 의심되며
새로운 primer로 PCR하면 정상적으로 나올겁니다.
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비수
(대학원생)
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20.04.06 16:08
새 프라이머로 진행했는데, 아직도 smearing 현상이 나타납니다ㅠㅠ
골치아프네요...
전기영동은 gel을 보는것이 해결하기에 도움이 됩니다.
새 primer로 smear하게 나오는 것이 primer 바꾸기 전과 pattern이 조금도 변하지
않았나요?
새 primer라는 것이 새로 주문한 primer인가요?
DNA를 standard method와 boiling method로 분리하여 비교를 한번 해보세요.
DNA 양은 10ng 이하로 사용하세요.
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레벨2
비수
(대학원생)
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20.04.07 16:16
첫번째와 마지막은 1kb ladder입니다.
2, 3번째는 kit를 이용하여 DNA를 추출했습니다.
4, 5번째는 boiling method로 추출했습니다.
2, 4번째는 기존에 사용하던 프라이머를 사용했고,
3, 5번째는 프라이머를 구입한뒤 DW를 넣지 않은 상태에서 상온 보관했던 제품인데, 이번에 DW를 넣은 프라이머입니다.
template DNA는 어디에 녹아있나요?
PCR 시 tube 당 얼마나 사용하나요?
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비수
(대학원생)
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20.04.07 16:49
Template DNA들은 TE버퍼에 녹아있습니다!
문제가 발생한 이후 TE버퍼에 DNase 오염이 발생했나 싶어서
새로 멸균하여 사용했지만 결과는 똑같았습니다!
그리고 PCR 수행시 template는 보통 2ul 넣고 PCR을 수행합니다.
template의 양이 문제인가 싶어 2ul와 1ul를 비교하여 진행했지만
역시나 동일한 결과였습니다ㅠㅠ
template DNA는 ul로 넣는것이 아니라 DNA양으로 넣어야 합니다.
현재 사용하는 DNA를 전기영동해 봤나요? 그리고 DNA양이 얼마나 되나요?
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레벨2
비수
(대학원생)
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20.04.07 17:41
DNA양은 어떻게 알 수 있나요?
나노드랍으로 측정해야 하나요?
아직 template로 사용하는 DNA를 전기영동 해보지는 않았습니다!
전기영동으로 한번 확인해 보는것이 좋을 듯 하며
DNA양은 A260에서 측정하면됩니다.