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질문 Agrobacterium 매개 형질전환 (GFP확인)
알2019D(대학원생)  |  04.03 16:36

안녕하세요~ 식물 형질전환 실험을 하고있는 대학원생입니다!

평소에도 Bric에 올라온 실험 Q&A 페이지를 보면서 많은 도움을 받다가 현재 형질전환 과정에서 겪고있는 문제에 대한 해결방법을 찾기 어려워 질문드리게 되었습니다.

제가 형질전환 하고자하는 식물은 유채 'Westar' 품종이며, EHA105 균주를 이용한 Agrobacterium  매개 형질전환법으로 실험중입니다.

종자발아 4-7일 후 얻은 실생묘의 하배축을 식물재료로 사용하는데  처음에는 절단면에서 캘러스가 형성되다가 시간이 지나면서 비절단부위에서도 캘러스가 터져나오는 양상이 보여 재료의 비절단면에서 생성되는 캘러스와 버드중에도 형질전환체가 있는지 확인해 보기위해 pBIN_mGFP5er을 이용하여 형질전환을 진행하였습니다.

접종 9일째 GFP를 확인해 본 결과 비절단면 뿐만아니라 절단면에서 나타난 캘러스에서도  WT과 유의미한 차이를 확인하지 못하였으며, 희끄무레한 하얀색만 보일 뿐 GFP 느낌의 형광이 나타나지 않아 현재 프로토콜로 형질전환이 되고 있는지에 대한 의문을 가지게 되었습니다. 

먼저 Inoculation 시간을 30분으로 늘려서 실험을 진행해 봤는데 아직 별 다른 효과를 보지 못하여 생각하던 중 Agrobacterium 균주에 따라서도 형질전환 효율에 큰 차이가 있을지에 대해 궁금해졌습니다.

Q1) 저는 형질전환 중 식물체 내에 유전자가 제대로 들어가지 못한다고 생각하고 있는데 이러한 경우 O.D 값을 올리거나 Inoclation 시간을 늘리는 방법, AS 농도를 높이는 방법 외에 어떤 해결방안이 있는지 궁금합니다. (+ Transformation에 이용하는 Agrobacterium 균주를 바꾸는것도 한가지 방안이 될 수 있을까요?)

Q2) 유채 형질전환체에서 접종일 기준으로 GFP 발현을 확인할 수 있는 가장 빠른 시기가 언제인지 알고싶습니다.

Q3)  그 외 제가 놓치고 있는 형질전환 효율을 높이기 위한 방법들에 어떤것들이 있는지 궁금합니다.

감사합니다!

#Agrobacterium
 
#형질전환
 
#유채
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
끄적  |  04.17 16:45   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
접종시간을 30분에서 1시간 정도 늘려보세요 그리고  OD값을 얼마로 하셨나요? 제가 실험했을 당시 좀 높았던걸로 기억이 되네요.. 
 
형광은 캘러스를 몇번 계대배양 해주면서 더 진하게 나타날수도 있어요 그리고 전체적으로 안보일때도 있구요
 
저도 학부가 식물조직배양이였고, 대학원도 형질전환으로 전공했었기때문에 지나가다 살짝쿵 글 남겨보고 갑니다.
 
잘 안되는게 있으면 옆에 선배들한테 물어보세요 
 
그리고 그쪽에 있어본 결과... 
 
무수한 실험도 중요하지만, 운도 필요하더라구요
 
정말 계속 실험이 안되다가 (항상 같은 방법으로 했는데) 어느순간 한번에 확 터져서 겨우 졸업논문 쓸수 있었습니다.
 
화이팅 하세요
알2019D  |  04.22 23:18  
답변 감사합니다! OD값은 0.5로 맞추어 진행하였고 현재 조금씩 높여서 비교실험을 하고있습니다~
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