실험 Q&A Plant Biology > Transformation
Agrobacterium 매개 형질전환 (GFP확인)
레벨1 2019D (대학원생)
안녕하세요~ 식물 형질전환 실험을 하고있는 대학원생입니다!
평소에도 Bric에 올라온 실험 Q&A 페이지를 보면서 많은 도움을 받다가 현재 형질전환 과정에서 겪고있는 문제에 대한 해결방법을 찾기 어려워 질문드리게 되었습니다.
제가 형질전환 하고자하는 식물은 유채 'Westar' 품종이며, EHA105 균주를 이용한 Agrobacterium 매개 형질전환법으로 실험중입니다.
종자발아 4-7일 후 얻은 실생묘의 하배축을 식물재료로 사용하는데 처음에는 절단면에서 캘러스가 형성되다가 시간이 지나면서 비절단부위에서도 캘러스가 터져나오는 양상이 보여 재료의 비절단면에서 생성되는 캘러스와 버드중에도 형질전환체가 있는지 확인해 보기위해 pBIN_mGFP5er을 이용하여 형질전환을 진행하였습니다.
접종 9일째 GFP를 확인해 본 결과 비절단면 뿐만아니라 절단면에서 나타난 캘러스에서도 WT과 유의미한 차이를 확인하지 못하였으며, 희끄무레한 하얀색만 보일 뿐 GFP 느낌의 형광이 나타나지 않아 현재 프로토콜로 형질전환이 되고 있는지에 대한 의문을 가지게 되었습니다.
먼저 Inoculation 시간을 30분으로 늘려서 실험을 진행해 봤는데 아직 별 다른 효과를 보지 못하여 생각하던 중 Agrobacterium 균주에 따라서도 형질전환 효율에 큰 차이가 있을지에 대해 궁금해졌습니다.
Q1) 저는 형질전환 중 식물체 내에 유전자가 제대로 들어가지 못한다고 생각하고 있는데 이러한 경우 O.D 값을 올리거나 Inoclation 시간을 늘리는 방법, AS 농도를 높이는 방법 외에 어떤 해결방안이 있는지 궁금합니다. (+ Transformation에 이용하는 Agrobacterium 균주를 바꾸는것도 한가지 방안이 될 수 있을까요?)
Q2) 유채 형질전환체에서 접종일 기준으로 GFP 발현을 확인할 수 있는 가장 빠른 시기가 언제인지 알고싶습니다.
Q3) 그 외 제가 놓치고 있는 형질전환 효율을 높이기 위한 방법들에 어떤것들이 있는지 궁금합니다.
감사합니다!
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