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질문 His-Tag protein 정제 관련해서 질문드려요.
개구리클레엉(대학원생)  |  04.03 16:12

안녕하세요. 저희가 주로 쓰던 Ni-NTA 칼럼이 단종되서 큐아젠의 Ni-NTA 칼럼으로 바꿨는데요, 단백질 정제가 약간 달라진듯 하여 질문드립니다.

 

저희의 단백질이 Monomer 와 tetramer 가 혼재해있는 단백질이고, 이중 tetramer 만 specific 하게 뽑아내야하기에 Ni-NTA로 한번 걸러주고 IEX 를 통해 한번 더 걸러주고 있습니다.

 

기존에 쓰던 칼럼에서는 tetramer 와 monomer 가 약 1:2 의 비율로 나왔다면, 큐아젠의 Ni-NTA 칼럼에서는 tetramer와 monomer 가 2:3, 즉 monomer 가 더 많이 잡히고 있습니다. 다만 큐아젠의 Ni-NTA칼럼에서는 binding 하는 tetramer의 양도 더 많아진 것을 볼 수 있었습니다.

 

그러다보니 IEX 과정에서도 깨끗하게 monomer 가 걸러지지 않는것 같습니다ㅠㅠ 제가 사용한 버퍼 조성은 아래와 같습니다.

 

 

Binding

Wash

Elution

Imidazole

-

20 mM

250 mM

Tris

20 mM

20 mM

20 mM

NaCl

10 mM

10 mM

10 mM

 

Ni-NTA 과정에서 Monomer 를 더 떨궈내야할거같은데...Wash의 Imidazole 농도나 Elution의 Imidazole 농도를 더 올려서 해봐야할까요?  어떻게 해야 현 상황을 개선 할 수 있을지 조언 주시면 감사하겠습니다.

 

참고로 기존에 쓰던 버퍼는 아래와 같습니다. 제가 아래 조성에서 위 조성으로 바꾼 것은 큐아젠으로 정제시 NaCl을 500mM 정도까지 쓰는 조성을 보지 못해서 너무 고염의 조건이 bead 에 좋지 못할까싶어서 바꿔보았었습니다.

 

binding

Wash

Elution

Imidazole

5mM

60mM

1M

Tris

20mM

20mM

20mM

NaCl

500mM

500mM

500mM

#protein
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.03 16:40  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

monomer와 tetramer가 용액 속에서 초기 비율이 변하는 조건이 있나요?

어차피 Ni-NTA에 붙는 his잔기 수가 동일하기 때문에 resin 문제가 아니라

초기 비율에 차이가 있는것이 아닐까 합니다.

IEX 실험은 어떻게 했나요?

IEX에서도 분리가 가능할 것으로 보이지만 SEC, GFC가 monomer vs. tetramer

분리에 더 적합할 것 같습니다.

개구리클레엉  |  04.05 16:55  

1. monomer와 tetramer가 용액 속에서 초기 비율이 변하는 조건이 있나요?

-> 시퀀스가 modify 되어있어서 일부는 이황화결합을 형성하여 tetramer를 만들고 일부는 그렇지 못하며 monomer 를 만드는 것으로 알고 있습니다.

 

2. 어차피 Ni-NTA에 붙는 his잔기 수가 동일하기 때문에 resin 문제가 아니라

초기 비율에 차이가 있는것이 아닐까 합니다.

IEX 실험은 어떻게 했나요?

IEX에서도 분리가 가능할 것으로 보이지만 SEC, GFC가 monomer vs. tetramer

분리에 더 적합할 것 같습니다.

 

-> IEX는 다음과 같은 조성을 이용해 실험했습니다. 

FPLC Bf A

FPLC Bf B#1

FPLC Bf B #2

20 mM

20 mM

20 mM

50 mM

1 M

2 M

1 mM

1 mM

1 mM

 

모노머를 더 없애주고자 FPLC B#2 로 먼저 모노머를 없애주고 버퍼체인지 후 FPLC B#1 로 최종 정제를 진행했습니다.

 

대왕개구리SPEED  |  04.05 21:00  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

IEX 조건에서 각 농도 별 성분이 안나와있네요.

그리고 성분의 농도 보다 컬럼 크기, gradient 조건이 더 중요한데 조건이

어떻게 되나요?

개구리클레엉  |  04.06 10:40  

 

FPLC Bf A

FPLC Bf B#1

FPLC Bf B #2

Tris(1M)

20 mM

20 mM

20 mM

NaCl(5M)

50 mM

1 M

2 M

EDTA(0.5M)

1 mM

1 mM

1 mM

 

복사붙여넣기를 하는 와중에 잘렸나봅니다 죄송합니다ㅠㅠ

1ml 짜리 Hitrap Q 칼럼을 이용해서 정제중이며, gradient 는 B buffer#1 의 경우 약 20퍼센트 중반에서 단백질이 검출되고 있습니다. 이 부분을 물어보시는게 맞는지요? 

대왕개구리SPEED  |  04.06 11:19  

몇분까지 B1 buffer 100%를 했나요?

그리고 유속은 1ml/min이고 washing 단계에서는 target이 안나오나요?

단백질 pI가 얼나나 되나요?

IEX 후 정제도가 98% 이상 나오나요?

개구리클레엉  |  04.06 15:51  

몇분까지 B1 buffer 100%를 했나요?

-> 몇분까지 B1 버퍼를 하셨냐는게 일차 정제 후 B1 버퍼를 얼마나 했냐는 말씀이신지요? 약 20분정도 했습니다.

그리고 유속은 1ml/min이고 washing 단계에서는 target이 안나오나요?

-> 유속은 0.8ml/min 입니다.  washing 단계에서 타겟이 안나오는 것으로 확인하였습니다.

단백질 pI가 얼나나 되나요?

-> theoritical PI 는 4.68 인데, 이건 sequence 상의 PI 인지라 tetramer 상태의 PI 가 이와 동일한지 모르겠습니다.

IEX 후 정제도가 98% 이상 나오나요?

-> IEX 후 PBS 로 버퍼체인지 후 최종 프로덕트의 쿠마씨 염색 결과는 아래와 같습니다. 60 근처의 밴드가 저희가 원하는 밴드 입니다. loading 양은 약 10ug 내외 입니다.

upload_image

 

대왕개구리SPEED  |  04.06 16:19  

IEX 정제도는 IEX 하기전과 후를 비교해야 정확히 알수 있습니다.

1. 0.2~0.3M NaCl에서 monomer가 elution되는 것 같은데 tetramer는 어느 농도에서

나오나요?

2. Q컬럼의 activation 방법과 평형화는 시간은 얼마나 진행했나요?

3. 평형화 buffer의 pH는 얼마인가요? 

개구리클레엉  |  04.06 16:46  

1. 0.2~0.3M NaCl에서 monomer가 elution되는 것 같은데 tetramer는 어느 농도에서 나오나요?

-> 모노머 나오고 나서 바로 뒤에 나옵니다. 아래의 사진을 첨부하겠습니다. 과량으로 나오는 모노머는 앞에서 많이 떨어져나가는 것 같습니다만 그래도 뒤에 좀 나오는 거 같습니다.

다른 분들의 데이터와 비교해보면 사실 Ni-NTA 조건을 더 개선해야할거 같긴합니다ㅠ

upload_image

2. Q컬럼의 activation 방법과 평형화는 시간은 얼마나 진행했나요?

-> DW 로 워시 20분간 해주고 FPLC A 버퍼로 약 20분간 흘려주었습니다.

3. 평형화 buffer의 pH는 얼마인가요? 

-> 평형화 버퍼 및 단백질 일루션 버퍼 모두 ph 는 7.4 입니다.

대왕개구리SPEED  |  04.06 17:47  

전기영동 gel을 보니 affinity에서 정제가 많이 되지 않았네요.

Q컬럼 activation은 0.5N NaOH로 20분간 레진에 흘려주고 DW로 20분 washing 후

buffer로 20분 평형화를 진행해주면 됩니다.

버퍼 pH는 6.5정도까지 사용 가능하며 pH가 내려가면 elution되는 NaCl 농도가

내려갑니다.

상대적으로 monomer와 tetramer의 elution 간격이 벌어질 것으로 보입니다.

또한 현재 조건이라면 30분간 elution을 하고 B buffer를 30분까지 0.8NaCl로

하면 될것 같습니다.

fraction 부피도 현재의 90% 정도로 줄여 받아 보세요.

[현재조건]

- flow : 0.8ml/min

- fraction vol. : 현재의 90%

- gradient

0 min : 0% B

30 min : 0.8M NaCl 

[변경조건]

- 평형화 buffer : 20mM Na-Pi buffer, pH6.5

- flow : 0.8ml/min

- fraction vol. : 현재의 90%

- gradient

0 min : 0% B

30 min : 0.8M NaCl 

 

개구리클레엉  |  04.06 17:56  

말씀하신 부분 한번 반영해서 진행해보겠습니다^^

혹시 affinity 단계에서 개선할 부분은 없을까요?

 

+)그리고 Q 칼럼 액티베이션 부분을 말씀하셨는데 그럼 지금까지 전 액티베이션이 안된 Q 칼럼을 사용한건가요?ㅠㅠ 

대왕개구리SPEED  |  04.06 18:04  

IEX-Q를 DW로 만하면 (-) charge가 activation이 거의 되지 않습니다.

affinity 조건 중에서는

1. washing을 20mM, 40mM, 60mM imidazole을 사용해서 전기영동으로 확안해서

target이 없는 최고 농도 imidazole을 찾아보세요.

2. elution은 100mM, 300mM, 600mM, 800mM로 elution해서 전기영동으로

target band의 수율을 확인해서 최고 농도의 imidazole 농도를 확인해 보세요.

아마도 600mM 이상은 사용하지 않아도 될 겁니다.

개구리클레엉  |  04.06 18:12  

affinity 정제부분 고려해서 해보겠습니다.

선배들에게 정제를 배울 떄 Q 칼럼 (-)  차지 부분을 배우지 않았어서 그냥 진행했었는데요...혹시 지금까지 Q 칼럼에 (-) 차지가 잘 안되었었다면, 단백질에도 문제가 있을까요? ㅠㅠ 엔도톡신 오염이라던가...제가 이 단백질을 재료로 다른 실험들을 하는 거라 걱정이 됩니다ㅠㅠ 

 

대왕개구리SPEED  |  04.06 18:50  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

요즘에는 IEX를 전문적으로 배운 젊은 연구자가 별로 없는 것 같습니다.

왜냐하면 예전에는 cloning해서 tag을 붙여서 affinity로 정제하지 않고

wild type으로 protein을 주로 정제를했기 때문에 IEX를 포함한 hydrophobic

interaction 컬럼 등을 많이 사용을 했습니다.

요즘에는 많이 사용하지 않아서 전문적으로 IEX를 하는 이론적인 배경이

약해진것 같습니다.

[AEX]

NaOH - DW - Buffer

[CEX]

HCl - DW - Buffer

위와같이 activation 및 평형화를 하면 됩니다.

평형화가 잘 안되었어도 단백질에는 아무런 문제가 없습니다.

엔도톡신은 또 다른 문제이고 나중에 문제가 되면 kit로 농도를 측정해 보고

농도가 높다면 제거하는 것은 별로 어렵지 않습니다.

그건 그때가서 고민해 볼 문제인것 같습니다.

개구리클레엉  |  04.06 18:54  

ㅠㅠㅠ 친절한 답변 감사합니다 선배님.

제가 Q 칼럼을 쓰는 굉장히 큰 이유중 하나가 엔도톡신 제거라서 액티베이션이 잘 안되었다고 하셔서 그 부분이 덜컥 걱정되어 여쭤봤습니다. 다음 정제 시 말씀하신 부분 반영해서 진행하겠습니다. 이론적 배경까지 설명해주셔서 감사합니다.

대왕개구리SPEED  |  04.06 19:36  

현재 pI에서는 Q말고 S나 CM 같은 건 pH3이하의 조건에서 해야 하기 때문에

단백질 stability가 있는 경우가 아니면 너무 산성 조건이어서 사용하지

못할겁니다.

Endotoxin이 Q 컬럼을 사용한다고 무조건 제거되지는 않습니다.

제거 조건을 찾아야 하고 제거하는 affinity 레진도 있습니다.

개구리클레엉  |  04.06 20:09  

너무나 친절한 설명 감사합니다.

실험 진행 후 다시 여쭙겠습니다^^ 

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