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 전체 > Immunology > Antibody
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질문 dot blot으로 나온 결과가 western blot으로는 나오지 않습니다
올챙이juyu21(대학원생)  |  04.02 15:50

몇달째 western blot결과가 나오지 않아 실험실에서 해볼 수 있는 

troubleshooting은 전부 해보았지만 결과가 나오지 않습니다.

antibody의 문제인지를 확인하기 위해 아래와 같은 조건으로 dot blot을

하여 결과를 확인하여 western blot에서는 1st Ab를 4도씨 overnight으로 조건을 바꾼것 외에는 모든 조건을 동일하게 하여 실험하였습니다.

하지만 WB에는 결과가 나오지 않았습니다. 혹시 몰라 detection 시간을 늘려봐도 band는 나타나지 않습니다. 이럴 경우에는 어떤 이유가 있을까요? 

1.샘플을 농도별로 희석하여 100℃에서 10min 끓이기
2.PVDF를 메탄올에 1분간 담근다
3.PVDF를 3M paper위에 얹어 살짝 마르면 샘플을 2 uL씩 loading
4.Dry 1 h, RT
5.Blocking 1 h, RT
6.Washing 10 min X3
7.1st Ab(1:500/ 1:1000) 1 h, RT
8.Washing 10 min X3
9.2nd Ab(1:2000) 1 h, RT
10.Washing 10 min X3
11.Detection
 
#western blot
 
#PVDF memebrane dot blot
 
#antibody
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  04.02 16:18  

Dot blot에서 100도, 10분을 진행하는 이유가 있나요?

대왕개구리강시  |  04.02 17:13  

negative control과 positive control 결과는 어떤가요?

올챙이juyu21  |  04.02 19:35  

먼저, 답변 주셔서 감사합니다.

dot blot에서 샘플을 끓인 이유는 W.B과 동일한 상황을 만들어야 한다고 생각했기 때문입니다. 

dot blot의 positive control에서는 점이 나타났으며, negative control은 걸지 않아서 답변드릴 수가 없습니다ㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  04.02 19:51  

Dot에서 잘 나왔다면 WBT에서도 잘 나오는게 일반적입니다.

transfer조건은 어떻나요?

우선 band가 지저분 해도 detection되는 것이 우선이기 때문에 fast WBT

방법으로

한번 확인해 보세요.

transfer 후  band확인 후 탈색

blocking RT 1hr

1st Ab RT-30도 1hr

washing

2nd Ab RT 1hr

washing

발색

fast 방법으로 지저분해도 band가 나오는지 우선 확인해 보세요.

올챙이juyu21  |  04.02 21:57  

transfer는 100V 1 h이며

gel은 쿠마시블루로, PVDF memebrane은 폰슈S로 염색하여 확인한 결과

이상 없었습니다.

개구리Q.E.D.  |  04.04 18:07  
첨부파일 파일첨부: Screenshot_20200404-175533_Adobe Acrobat.jpg (1,130 KB)
이미지 첨부파일
안녕하세요^ ^
제가 답변을 늦게 해 드려서 미안하네요ㅜ,ㅜ
우선 그 동안 올린 정보들을 조합 해 보니
이건 WB의 문제라기 보다는
처음 샘플을 제조 할 때 문제가 있을 수 있겠어요
보려는게 TLR4이면 이거 어떤 세포주에서
어느 약물을 처리해서 유도를 하나요?
수용체라서 위치상에 문제도 있을 수 있구요
이거 샘플 만드는건 어떤 방법을 사용했나요?
Positive control이 나왔는데
본인 샘플이 안 나온거면 샘플 문제가 큽니다.
세포 반응이 나오는건지부터 확인하세요
B-actin 같은 경우야, 속된말로 발로해도 나와요

우선 샘플 문제라고 하고도
WB시에 문제점과 수정 할 점 4가지를
말씀드릴께요

우선 보려는 단백질 사이즈가 90-120kDa면
지금 gel %는 맞는데 혹시라도
Tricine gel이라면
(이건 작은 사이즈일때 많이 써요)
Glycine이 베이스가 되는 gel을 사용하시구요

그리고 1.0mm gel이면
웬만해서 40ug을 안 넘기는게 좋은데
지금 300ug이면 이건 밴드가 떠도
버려야 하는 결과가 나와요
b-actin만 하더라도 정량이 들쭉날쭉하고
detection이 두껍게 되서 이 사진을
정량용으로는 채택하지 않아요.
쓰는게 이상한 거랄까요~^^
단백질 농도를 확 낮춰도 나올거면 나옵니다
그래도 농도를 못 낮추겠다면 적어도
1.5mm gel 을 사용하세요

그리고 1차 ab가 안 나오는 경우는 4도에서
3일도 붙여봤는데
확실히 안 나오는게 그렇게 할 때
나온적이 많은데 수용체라서 더 그럴수도
있으니까 이 부분도 고려를 하세요

그리고 이렇게 안 나오는건
Blockig을 많이 하지 마세요
3%에서 5min 정도만 하고
1차 항체를 붙일 베이스를
1% BSA를 기본 베이스로 한다던가
1% skim milk를 베이스로 하던지
항체를 만들때 베이스가 되는걸로 하면
O/N되면서 같이 되서 깨끗하게 나와요
게다가 monoclonal 항체라서 나오면
깨끗하게 뜨니까 어떤 베이스를 쓰는지도
체크해 보세요.

사용하는 농도는 괜찮은 편인데
전 WB를 정말 잘 하는데??ㅋㅋ도
안 나오던게 있어서 마지막에는
1:200 3일 붙여서 겨우 나온적도 있으니까
농도 변화도 줘 보시구요

무튼 아직도 바꿔볼건 많으니까
안 나온다고 좌절하지 말고 차근차근 해 보세요
그리고 정말 속상하겠지만 주변에 다른 곳에서
필름말고 다른 케미덕을 쓸 수 있나도 한 번
알아보세요!!

그럼 수고하세요~~~
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