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Dot blot에서 100도, 10분을 진행하는 이유가 있나요?
negative control과 positive control 결과는 어떤가요?
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레벨4
juyu21
(대학원생)
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20.04.02 19:35
먼저, 답변 주셔서 감사합니다.
dot blot에서 샘플을 끓인 이유는 W.B과 동일한 상황을 만들어야 한다고 생각했기 때문입니다.
dot blot의 positive control에서는 점이 나타났으며, negative control은 걸지 않아서 답변드릴 수가 없습니다ㅜㅜ
Dot에서 잘 나왔다면 WBT에서도 잘 나오는게 일반적입니다.
transfer조건은 어떻나요?
우선 band가 지저분 해도 detection되는 것이 우선이기 때문에 fast WBT
방법으로
한번 확인해 보세요.
transfer 후 band확인 후 탈색
blocking RT 1hr
1st Ab RT-30도 1hr
washing
2nd Ab RT 1hr
washing
발색
fast 방법으로 지저분해도 band가 나오는지 우선 확인해 보세요.
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레벨4
juyu21
(대학원생)
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20.04.02 21:57
transfer는 100V 1 h이며
gel은 쿠마시블루로, PVDF memebrane은 폰슈S로 염색하여 확인한 결과
이상 없었습니다.
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레벨1
Q.E.D.
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20.04.04 18:07
안녕하세요^ ^
제가 답변을 늦게 해 드려서 미안하네요ㅜ,ㅜ
우선 그 동안 올린 정보들을 조합 해 보니
이건 WB의 문제라기 보다는
처음 샘플을 제조 할 때 문제가 있을 수 있겠어요
보려는게 TLR4이면 이거 어떤 세포주에서
어느 약물을 처리해서 유도를 하나요?
수용체라서 위치상에 문제도 있을 수 있구요
이거 샘플 만드는건 어떤 방법을 사용했나요?
Positive control이 나왔는데
본인 샘플이 안 나온거면 샘플 문제가 큽니다.
세포 반응이 나오는건지부터 확인하세요
B-actin 같은 경우야, 속된말로 발로해도 나와요
우선 샘플 문제라고 하고도
WB시에 문제점과 수정 할 점 4가지를
말씀드릴께요
우선 보려는 단백질 사이즈가 90-120kDa면
지금 gel %는 맞는데 혹시라도
Tricine gel이라면
(이건 작은 사이즈일때 많이 써요)
Glycine이 베이스가 되는 gel을 사용하시구요
그리고 1.0mm gel이면
웬만해서 40ug을 안 넘기는게 좋은데
지금 300ug이면 이건 밴드가 떠도
버려야 하는 결과가 나와요
b-actin만 하더라도 정량이 들쭉날쭉하고
detection이 두껍게 되서 이 사진을
정량용으로는 채택하지 않아요.
쓰는게 이상한 거랄까요~^^
단백질 농도를 확 낮춰도 나올거면 나옵니다
그래도 농도를 못 낮추겠다면 적어도
1.5mm gel 을 사용하세요
그리고 1차 ab가 안 나오는 경우는 4도에서
3일도 붙여봤는데
확실히 안 나오는게 그렇게 할 때
나온적이 많은데 수용체라서 더 그럴수도
있으니까 이 부분도 고려를 하세요
그리고 이렇게 안 나오는건
Blockig을 많이 하지 마세요
3%에서 5min 정도만 하고
1차 항체를 붙일 베이스를
1% BSA를 기본 베이스로 한다던가
1% skim milk를 베이스로 하던지
항체를 만들때 베이스가 되는걸로 하면
O/N되면서 같이 되서 깨끗하게 나와요
게다가 monoclonal 항체라서 나오면
깨끗하게 뜨니까 어떤 베이스를 쓰는지도
체크해 보세요.
사용하는 농도는 괜찮은 편인데
전 WB를 정말 잘 하는데??ㅋㅋ도
안 나오던게 있어서 마지막에는
1:200 3일 붙여서 겨우 나온적도 있으니까
농도 변화도 줘 보시구요
무튼 아직도 바꿔볼건 많으니까
안 나온다고 좌절하지 말고 차근차근 해 보세요
그리고 정말 속상하겠지만 주변에 다른 곳에서
필름말고 다른 케미덕을 쓸 수 있나도 한 번
알아보세요!!
그럼 수고하세요~~~