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 전체 > Cell Biology > Cell Cycle
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질문 [Flow cytometry] Cell cycle 분석 (PI staining) 사용 후 gating 관련하여 도움이 필요합니다.
알lusion(대학원생)  |  04.02 01:32

유세포 분석을 처음해보는 초보라 부족함이 많습니다 ㅠㅠ 

 

종양세포에 약물 처리 후 효과를 확인하는 과정 중 G2/M arrest를 관찰하였는데요~ gating 중에 이상한 부분이 관찰되어서 어떻게 해석해야할지 어려움이 있어 글을 올리게 되었습니다.

약물은 0.2uM-50uM 까지 사용하였고, IC 50는 1uM 정도였습니다. 

게이팅은 아래와 같이 진행하였구요[1번 사진]

upload_image

이를 통해 아래와 같은 cell cycle 데이터를 얻었습니다.

upload_image

 

 

1. 게이팅 하는 방법 중에 PI를 log상태로 보길래 해서 보았는데 아래와 같이 농도가 올라감에 따라 control에 비해 G2/M쪽으로 생각되는 부분에 2가지로 변하는 모양이 보이는데, 고농도 약물을 사용하여 세포에 변화가 발생하여 보이는 것으로 보아도 되는 걸까요? 아래 2번째 사진의 다른 세포주에서도 같은 결과가 나와서 고농도에서 저렇게 변하는것 습니다. 

upload_image

 

 

2. Sub-G1 데이터까지 같이 얻어서 apoptosis를 같이 표현하고 싶은데, 

2-1) 게이팅 표현 방법은 괜찮은지요?

2-2) 배지를 모두 함께 모아서 뜬 세포도 함께 보는게 맞는건지

2-3) trypsin으로 떼어서 harvest해서 보는데, sub-G1을 표현하는데 문제가 되지는 않으려는지요?

 

주변에 세포 실험하시는 분들이 없어 간단한 조언이라도 큰 도움이 될 것 같습니다. ㅠㅠ 

#Flow cytometry
 
#Cell cycle
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리아이스티  |  04.02 16:47  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Facs를 하긴하는데 gating은 다른 분이 해주셔서 답변드리기 힘드네요ㅠㅠ

sub-G1으로 apoptosis를 보기에는 어떤게 죽은 세포이고, cell debris인건지 구분하기 애매하기 때문에

PI staining만으로 확인하는건 별로 추천하지는 않습니다. 

Annexin V를 이용해서 apoptosis 확인하는 방법도 있으니 참고해보세요.

 

2-2)배지는 버리고 trypsin후 얻은 세포만으로 봅니다.

2-3)저는 배지는 전부 PBS washing하고 버리고, trypsin해서 PI staining 진행합니다.

sub G1 표현하는데 큰 문제 없습니다.

알lusion  |  04.02 21:09  

감사합니다~ 

Annexin V도 하려고 준비중이었는데, apoptosis는 이 염색으로 확인해야겠네요~

 

혹시 게이팅 부분에도 조언 주실 수 있는 분 있으시면 부탁드리겠습니다.

 

sunyieve363@nate.com  |  04.06 17:21   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cell cycle 관련 연구자입니다.

 

일단 FACS같은 경우는 지금 X축 Y축이 의미하는 것 부터 파악하셔야 할것 같습니다. SSC, FSC등이 세포 크기, 세포내 복잡성 등을 의미하는 경우가 있어서 그렇다면 세포에서 어떤 현상이 나타나는지 유추하며 분류하실수 있으실 겁니다.

 

그리고 apoptosis까지 보고싶으시다면 배지까지 모두 하베스트 하셔야 합니다. 그러면  Sub-G1 피크가 올라가게됩니다.

 

아마 약물을 더 오래 처리하면 이 피크가 더 높아지겠죠? 이유는 apoptosis가 진행된 세포는 바닥에 attach 되어있지 않고 둥둥 뜨게됩니다

이런 세포들이 많아지는 상태에서 배지를 버려버리면 원하는 값을 나타낼 세포들을 버리게 되는 셈이죠

 

그리고  FACS로 surface marker등을 확인하는게 아닌 경우에는트립신 처리해서 보셔도 됩니다.

 

Sub-G1 범위도 잘 잡으셨고 데이터 매우 깔끔하게 잘 나온 것 같은데

배지까지 모아서 한번 해보세요 좀더 드라마틱 할 겁니다

알lusion  |  04.06 23:04  

감사합니다~

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