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질문 제한효소 처리 후 밴드 3개 질문드립니다!
올챙이해징(대학원생)  |  03.31 18:22
첨부파일 파일첨부: DDD.jpg (61 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요. 클로닝 처음 해보는 석사생입니다.

실험실에 선배가 없어 브릭 도움을 많이 받아서 클로닝을 진행중입니다!

저는 발현벡터 pET23d(3.66kb)에 insert(4.65kb)를 넣어서 확인하는 과정에 있습니다.

forward에는 Not1, Reverse에는 EcoR1을 넣어서 프라이머를 짰고

먼저 EcoR1 처리를 해서 밴드를 확인한 후 사이즈에 맞는 밴드를 확인했습니다.

그 후 gel extraction 후 Not1 처리후 밴드를 확인했습니다.

겔 상에서 2,3 번 레인은 사이즈에 맞게 잘린 거 같다는 생각이 들었는데 4번 레인은 밴드가 3개로 보여서 왜 그런건지 도대체 모르겠어서 질문 드립니다.

Q1. 2,3번 레인은 사이즈에 맞게 잘린게 맞을까요? 저 중 하나로 sequencing 진행해도 괜찮겠죠??

Q2. 4번 레인에서 밴드가 3개인 이유가 다 안 잘려서 3개 일까요?

너무 단순한 질문이라면 죄송합니다 ㅠ 처음해보는 거라서 친절하게 답변해주시면 감사하겠습니다!! 감사합니다~

#DNA
 
#클로닝
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
알allal  |  03.31 18:32  

마커랑 비교해서 보았을때 4번 레인 밴드 3개 중에 제일 아래가 pET23d 고, 가운데가 인서트 같아요

2,3,4 레인에 보이는 맨 윗밴드가 5.몇 인듯 보이는데, 그게 무엇인지 찾아보는게 좋을것 같습니다. 

cloning 다 하시구 seq으로 확인 하는 단계이시면, 4번 레인을 가지고 시퀀싱 해보면 좋을것 같아요!

대왕개구리SPEED  |  03.31 18:42  

2, 3, 4번 모두 맞는 DNA고 4번 중간 band는 안잘린 band입니다.

또한 확인하기 위해서 전기영동 할 때는 확실하게 확인 가능하도록

DNA양을 충분히 loading해야 합니다.

2배 정도 양을 올려서 실험하면 좋을 듯 합니다.

염기서열 분석 비용이 저렴하기 때문에 PCR product의 경우 base error도 예상

해야 하기 때문에 3개 정도 염기서열 분석을 해보세요.

그리고 4kb이상의 insert이기 때문에 양방향으로 모두 읽을수 없고

primer-walking sequencing을 하면 됩니다.

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