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질문 pNZ7021에 클로닝 후 단백질 발현
알chj520(대학원생)  |  03.30 17:36
pNZ7021에 클로닝하고 시컨싱을 아무리 해봐도 제대로 다들어갔는데 대장균(ㅇMC1061)에서도 유산균(L.casei)에서도 단백질 발현이 안됩니다....
무엇을 고려해보아야 할까요?
#pnz7021
 
#MC1061
 
#Protein expression
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.30 17:59  

1. MCS 어느 자리에 cloning 했나요?

2. chloramphenicol(CM) 배지에서 잘 자라나요?

3. 발현 배지는 어떤 배지를 사용했고 CM은 넣었나요?

5. 몇시간 배양해서 발현을 확인했거 어떤 방법으로 확인했나요?

대왕개구리강시  |  03.30 18:04  

벡터에 제대로 클로닝이 되었다면,

유전자 Sequence가 확실하다면,

codon bias가 심하지 않은가를 먼저 살펴보세요. 

알chj520  |  03.30 21:44  
@speed
1. MCS 어느 자리에 cloning 했나요?
Sph1과 EcoR1으로 넣었습니다.start codon 프레임도 다 확인했구요~
2. chloramphenicol(CM) 배지에서 잘 자라나요?
Host의 CM MIC test 후 진행해서 transformanant는 잘 자랍니다.
3. 발현 배지는 어떤 배지를 사용했고 CM은 넣었나요?
MRS media에 selection marker는 넣었습니다.
5. 몇시간 배양해서 발현을 확인했거 어떤 방법으로 확인했나요?
Colony 1개를 full growth 가 될 때까지 키우는데요~ 약 24시간 소요됩니다. 확인은 western blot으로 합니다.

짚어주신 부분에서는 그닥 실수한것으로 보이지 않는데...
알chj520  |  03.30 21:51  
@강시
그렇잖아도..그부분이 좀 마음에 걸려 확인을 해보았는데 major가 아닌 코돈이 좀 있긴하더라구요...rosetta gami 로 옮겨서 확인해볼까도 생각해 보았습니다. 하지만...발현하려는 단백질이 유산균의 chaperone 일부조각이라....발현이 잘 되어야 하는 것이 아닌가도 싶어요.
대왕개구리SPEED  |  03.30 22:42  

1. 배양 시간을 48시간까지 해 보세요.

2. 이 vector가 대장균, 유산균에 사용가능하지만 L. lactis를 대상으로

개발되었습니다.

가능하다면 L. lactis에서 확인을 한번 해세요.

3. 이 vector에 EcoRI 자리가 없는 것 같고 EcoRI과 compatible end도 없는것

같은데 EcoRI을 사용한게 맞나요?

4. 구성적 promoter라서 발현양이 유도 promoter 보다는 적게 나오지만

그래도 전기영동에서 확인 가능할 정도로 많이 나옵니다.

cell lysis 후 WBT이 아니라 SDS-PAGE에서 확인을 우선 해 보세요.

알chj520  |  03.31 14:08  
@SPEED
3.벡터 개량중이라 제가 넣은 MCS에 EcoR1이 있습니다.
4. 원하는 사이즈 근처에서 그렇다할 band가 관찰되지않아 wb 진행했습니다.

프로모터와 궁합이 맞지않는건지...참...안되네요..
대왕개구리SPEED  |  03.31 14:34  

발현이 잘되는 vector라서 codon usage, promoter activity 모두 균주에 적합합니다.

어느 부분을 변경했나요?

그리고 권장 배지를 사용해서 48시간 정도 배양해 보세요.

알chj520  |  03.31 14:47  
@speed
프로모터와 MCS를 바꿔서 타겟단백질을 발현하려는 중에 control로 pNZ7021의 PepN promoter와 비교중입니다. 모두...발현이 안되네요..
일단...배양시간도 늘려보겠습니다....
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