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1. MCS 어느 자리에 cloning 했나요?
2. chloramphenicol(CM) 배지에서 잘 자라나요?
3. 발현 배지는 어떤 배지를 사용했고 CM은 넣었나요?
5. 몇시간 배양해서 발현을 확인했거 어떤 방법으로 확인했나요?
벡터에 제대로 클로닝이 되었다면,
유전자 Sequence가 확실하다면,
codon bias가 심하지 않은가를 먼저 살펴보세요.
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레벨1
chj520
(대학원생)
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20.03.30 21:44
@speed
1. MCS 어느 자리에 cloning 했나요?
Sph1과 EcoR1으로 넣었습니다.start codon 프레임도 다 확인했구요~
2. chloramphenicol(CM) 배지에서 잘 자라나요?
Host의 CM MIC test 후 진행해서 transformanant는 잘 자랍니다.
3. 발현 배지는 어떤 배지를 사용했고 CM은 넣었나요?
MRS media에 selection marker는 넣었습니다.
5. 몇시간 배양해서 발현을 확인했거 어떤 방법으로 확인했나요?
Colony 1개를 full growth 가 될 때까지 키우는데요~ 약 24시간 소요됩니다. 확인은 western blot으로 합니다.
짚어주신 부분에서는 그닥 실수한것으로 보이지 않는데...
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레벨1
chj520
(대학원생)
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20.03.30 21:51
@강시
그렇잖아도..그부분이 좀 마음에 걸려 확인을 해보았는데 major가 아닌 코돈이 좀 있긴하더라구요...rosetta gami 로 옮겨서 확인해볼까도 생각해 보았습니다. 하지만...발현하려는 단백질이 유산균의 chaperone 일부조각이라....발현이 잘 되어야 하는 것이 아닌가도 싶어요.
1. 배양 시간을 48시간까지 해 보세요.
2. 이 vector가 대장균, 유산균에 사용가능하지만 <em>L. lactis</em>를 대상으로
개발되었습니다.
<u>가능하다면</u> <em>L. lactis</em>에서 확인을 한번 해세요.
3. 이 vector에 <em>EcoR</em>I 자리가 없는 것 같고 <em>EcoR</em>I과 compatible end도 없는것
같은데 <em>EcoR</em>I을 사용한게 맞나요?
4. 구성적 promoter라서 발현양이 유도 promoter 보다는 적게 나오지만
그래도 전기영동에서 확인 가능할 정도로 많이 나옵니다.
cell lysis 후 WBT이 아니라 SDS-PAGE에서 확인을 우선 해 보세요.
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레벨1
chj520
(대학원생)
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20.03.31 14:08
@SPEED
3.벡터 개량중이라 제가 넣은 MCS에 EcoR1이 있습니다.
4. 원하는 사이즈 근처에서 그렇다할 band가 관찰되지않아 wb 진행했습니다.
프로모터와 궁합이 맞지않는건지...참...안되네요..
발현이 잘되는 vector라서 codon usage, promoter activity 모두 균주에 적합합니다.
어느 부분을 변경했나요?
그리고 권장 배지를 사용해서 48시간 정도 배양해 보세요.
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레벨1
chj520
(대학원생)
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20.03.31 14:47
@speed
프로모터와 MCS를 바꿔서 타겟단백질을 발현하려는 중에 control로 pNZ7021의 PepN promoter와 비교중입니다. 모두...발현이 안되네요..
일단...배양시간도 늘려보겠습니다....