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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 large plasmid를 agarose gel에서 확인하고 싶습니다.
알휴가가필요해(대학원생)  |  03.27 16:34

안녕하세요

균에 존재하는 large plasmid를 agarose gel에서 확인하고자 합니다.

대략적인 size는 80kb입니다.

overnight한 균주를 kit를 사용하여 miniprep하였고 0.5% agarose gel에서 3시간정도 내렸는데 well에서 빠져나오지를 못하는 것 같습니다.

사진을 보면 well아래쪽에 밝게 band가 보이고 전혀 내려가지 않습니다.

논문을 보면 잘들 내려가던데 무엇이 문제일까요??ㅠㅠ

 

#large plasmid
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.27 16:37  

사진이 없습니다.

알휴가가필요해  |  03.27 16:42  
첨부파일 파일첨부: 0003.jpg (162 KB)
이미지 첨부파일

사진입니다. 80kb에 맞는 marker가 없어서 일반 marker를 일단 걸었으나 오래 내려서 다 내려간 상황입니다.

대왕개구리SPEED  |  03.27 16:45  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

0.5% gel에서 80kb는 충분히 내려갑니다.

well에 형광 빛이 난다고 well에 DNA가 걸린건 아닙니다.

DNA 분리 후 purity와 양은 얼마나 나왔나요?

그리고 어떤 방법으로 plasmid를 분리했나요?

아마도 plasmid 분리가 안되었을 겁니다.

 

알휴가가필요해  |  03.27 17:03  

답변감사드립니다.

3개 sample은 순서대로

concentration 70.48, 41.73, 9.904

260/280 1.362, 1.523, 1.807

260/230 1.192, 1.361, 1.030

으로 나왔습니다. purity가 안좋은 것 같네요ㅠ

 

사용한 kit는 invitrogen purelink를 사용했습니다.

large plasmid를 뽑는다고 익숙하지 않은 kit를 사용했는데 원래 사용하던 kit로 다시 뽑아보겠습니다.

대왕개구리SPEED  |  03.27 17:48  

kit도 사용해보고 manual로 alkaline lysis방법도 사용해 보세요.

대왕개구리강시  |  03.28 07:42  

80kb plasmid.....

Pseudomonas 같은 균인가요?

250kb 짜리 BAC 도 대장균 1.5ml culture에서 kit나 manual로 뽑아서 실험합니다.

제대로 뽑았다면 agarose gel에서 안보일리 없겠지만 그람양성균일때는 인보일 수도 있습니다. 그럴때는 cell wall lysis에 신경써야 합니다.

 

large plasmid의 정제는 alkaline lysis를 준용하되 Sol2, 3 단계를 조심하면 됩니다.

1. cell harvest, 1.5ml. cell 양이 많으면 오히려 수율이 떨어지거나 깨꿋해지기 어려움

2. Sol1 200ul 넣고 voltex, (lysozyme 은 넣지 않아도 되고, RNaseA는 넣어주고), 상온에 5분

3. tube를 45도로 기울여서 Sol2 400ul 가 tube 벽을 타고 내려가도록 넣어주되 되도록 부드럽게.

4. 즉시 tube를 매우매우 부드럽게 4-5회 뒤집으며 섞는다.(Sol2 단계는 시간을 지채할수록 plasmid 전제되는 양이 줄어듭니다.)

5. 즉시 Sol3를 첨가하되 tube를 45도로 기울여서 Sol3가 tube 벽을 타고 내려가도록.

6. tube를 매우매우 부드럽게 4-5회 뒤집으며 섞는다.

7. 얼음속에 10분

8. 4도시에서 원심분리 10분.

9. 새 tube에 sup을 옮기고 다시한 번 더 4도시에서 원심분리 10분. (phenol extraction은 불필요)

10. IPA로 침전시키고 RNaseA 들어간 DW 50ul 에 녹이고 그 중 10를 적당한 제한효소로 잘라서 젤을 걸어본다. 이때 안자른 10ul 도 같이 걸어 본다.

11.(10 번 단계를 다른 방법으로) absolute EtOH을 동일 부피 넣어서 섞어주고 즉시 plasmid miniprep 컬럼에 넣어서 원심분리, 양이 많으면 원심분리 후 남은 plasmid-EtOH 을 다시 같은 컬럼에 넣어서 원심분리, washing, 50ul elution 하면 됩니다. 그 중 10를 적당한 제한효소로 잘라서 젤을 걸어본다. 이때 안자른 10ul 도 같이 걸어 본다.

 

large plasmid는 supercoil form을 걸면 농도가 낮아보입니다.

제한효소를 처리하면 같은 양의 supercoil 보다 gel에서 양이 더 많아 보이므로 반드시 안자른 plasmid와, 같은 양의 자른 pasmid를 같이 걸어보시길 권합니다.

최종 분리한 plasmid를 너무 소량에 녹이면 다루기가 어렵고 50ul정도에 녹여서 1/5 정도를 자르거나 gel loading하면 적당합니다.

*Sol2, 3 단계는 매우 부드럽게,

Sol 2 단계는 10초를 넘지 않게 하세요.

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