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레벨1
휴가가필요해
(대학원생)
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20.03.27 16:42
사진입니다. 80kb에 맞는 marker가 없어서 일반 marker를 일단 걸었으나 오래 내려서 다 내려간 상황입니다.
0.5% gel에서 80kb는 충분히 내려갑니다.
well에 형광 빛이 난다고 well에 DNA가 걸린건 아닙니다.
DNA 분리 후 purity와 양은 얼마나 나왔나요?
그리고 어떤 방법으로 plasmid를 분리했나요?
아마도 plasmid 분리가 안되었을 겁니다.
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레벨1
휴가가필요해
(대학원생)
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20.03.27 17:03
답변감사드립니다.
3개 sample은 순서대로
concentration 70.48, 41.73, 9.904
260/280 1.362, 1.523, 1.807
260/230 1.192, 1.361, 1.030
으로 나왔습니다. purity가 안좋은 것 같네요ㅠ
사용한 kit는 invitrogen purelink를 사용했습니다.
large plasmid를 뽑는다고 익숙하지 않은 kit를 사용했는데 원래 사용하던 kit로 다시 뽑아보겠습니다.
kit도 사용해보고 manual로 alkaline lysis방법도 사용해 보세요.
80kb plasmid.....
Pseudomonas 같은 균인가요?
250kb 짜리 BAC 도 대장균 1.5ml culture에서 kit나 manual로 뽑아서 실험합니다.
제대로 뽑았다면 agarose gel에서 안보일리 없겠지만 그람양성균일때는 인보일 수도 있습니다. 그럴때는 cell wall lysis에 신경써야 합니다.
large plasmid의 정제는 alkaline lysis를 준용하되 Sol2, 3 단계를 조심하면 됩니다.
1. cell harvest, 1.5ml. cell 양이 많으면 오히려 수율이 떨어지거나 깨꿋해지기 어려움
2. Sol1 200ul 넣고 voltex, (lysozyme 은 넣지 않아도 되고, RNaseA는 넣어주고), 상온에 5분
3. tube를 45도로 기울여서 Sol2 400ul 가 tube 벽을 타고 내려가도록 넣어주되 되도록 부드럽게.
4. 즉시 tube를 매우매우 부드럽게 4-5회 뒤집으며 섞는다.(Sol2 단계는 시간을 지채할수록 plasmid 전제되는 양이 줄어듭니다.)
5. 즉시 Sol3를 첨가하되 tube를 45도로 기울여서 Sol3가 tube 벽을 타고 내려가도록.
6. tube를 매우매우 부드럽게 4-5회 뒤집으며 섞는다.
7. 얼음속에 10분
8. 4도시에서 원심분리 10분.
9. 새 tube에 sup을 옮기고 다시한 번 더 4도시에서 원심분리 10분. (phenol extraction은 불필요)
10. IPA로 침전시키고 RNaseA 들어간 DW 50ul 에 녹이고 그 중 10를 적당한 제한효소로 잘라서 젤을 걸어본다. 이때 안자른 10ul 도 같이 걸어 본다.
11.(10 번 단계를 다른 방법으로) absolute EtOH을 동일 부피 넣어서 섞어주고 즉시 plasmid miniprep 컬럼에 넣어서 원심분리, 양이 많으면 원심분리 후 남은 plasmid-EtOH 을 다시 같은 컬럼에 넣어서 원심분리, washing, 50ul elution 하면 됩니다. 그 중 10를 적당한 제한효소로 잘라서 젤을 걸어본다. 이때 안자른 10ul 도 같이 걸어 본다.
large plasmid는 supercoil form을 걸면 농도가 낮아보입니다.
제한효소를 처리하면 같은 양의 supercoil 보다 gel에서 양이 더 많아 보이므로 반드시 안자른 plasmid와, 같은 양의 자른 pasmid를 같이 걸어보시길 권합니다.
최종 분리한 plasmid를 너무 소량에 녹이면 다루기가 어렵고 50ul정도에 녹여서 1/5 정도를 자르거나 gel loading하면 적당합니다.
*Sol2, 3 단계는 매우 부드럽게,
Sol 2 단계는 10초를 넘지 않게 하세요.