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질문 정제한 펩타이드 투석, 여과 결과인데 도와주세요 ㅠ,ㅠ
앞다리졸업은언제하나(대학원생)  |  03.25 13:14
첨부파일 파일첨부: 슬라이드1.JPG (159 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요.

저번에 대장균에서 펩타이드 발현, 정제 후 여과과정에서 샘플이 사라졌던 학생입니다.

연구실에 SDS, WB 소모품 배송이 늦어져서 실험 결과를 좀 늦게 가져왔습니다.ㅠㅠ

 

전체적인 발현, 정제, 여과 과정은

1. E. coli로부터 IPTG induction 후, 원심분리를 이용하여 cell 수거.

2. 수거한 cell에 50 mM sodium phosphate/300 mM NaCl (pH 8.0) 버퍼를넣고 sonication으로 파쇄.

3. 파쇄액은 원심분리로 pellet과 sup.으로 나누어 SDS, WB 진행 (①번 결과).

4. sup.에 있는 펩타이드를 IMAC으로 정제 (150 mM에서 elution 됨) (③번 결과).

 

첨부한 사진처럼 정제~투석, 여과 과정에서 샘플 펩타이드 일부가 절편화되고, filter membrane에 흡착되어 사라지는 것같은데...

어떻게 해야 온전한 펩타이드를 받을 수 있을지 의문입니다.

실험에 동일한 과정으로 정제한 샘플들은 따로 절편화되지 않고 정제가 되었는데, 이 샘플만 자꾸 문제가 생깁니다.

제가 다시 발현 후 정제를 진행해보았는데도, 같은 결과를 얻었습니다.

현재는 발현에 사용한 재조합 DNA vector를 다시 준비해서 transformation을 하여 새로 발현을 진행하고 있습니다만, 그것도 결과를 봐야알 것 같습니다.

 

혹시 저처럼 발현 후 정제~투석, 여과 과정에서 샘플이 잘리거나 제거되는 경우는...ㅠ.ㅠ 어떻게 해결해나가야할까요....

이 펩타이드가 제 학위논문의 마지막 펩타이드가 되는 상황인데요...ㅠㅠ

 

 

감사합니다!

코로나 조심하세요!

 

 

#발현
 
#peptide
 
#절편
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.25 13:42  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 사용한 투석액과 UF시 사용한 buffer 조성은 어떻게되나요?

2. UF 시 사용한 시료 부피와 buffer change를 몇ml씩 몇번을 했나요?

올챙이무정형  |  03.25 14:47  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

안녕하세요.

혹시 실험과정에 protease inhibitor cocktail 같은 시약을 넣어서 해보시면 어떨까요?

앞다리졸업은언제하나  |  03.25 15:27  

안녕하세요  SPEED님!

UF시 버퍼는 50 mM sodium phosphate/300 mM NaCl (pH 8.0)로 진행하였습니다!

500 ul 를 내려서 50 ul로 받은 후 수거해서 로딩도 해보고,

수거한 것을 다시 400 ul 50 mM sodium phosphate/300 mM NaCl (pH 8.0)에 넣고 다시 내려서 50 ul로 받은 후 로딩해 보았을 때에도 둘 다변함없이 타겟이 사라졌었습니다.

그 후로 추가로 진행하지는 않았습니다.

============================================

무정형님께서 말씀해주신 부분은 아직 해보지는 않았습니다.

연구실 내에서  protease inhibitor cocktail은 아직 시도해본 적이 없습니다.

여태까지 연구실에서 저 처럼 정제~여과 과정에서 절단이 일어나는 문제가 없었어서 그랬던 것 같습니다.

찾아보고 지도교수님과 상의 후 시도해 보겠습니다. 검색해보니 다카라나 고마바이오텍에서도 구매가 가능한 것 같은데 조금 더 찾아봐야할 것 같습니다.

============================================

감사합니다!!

 

 

 

대왕개구리SPEED  |  03.25 16:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

저번 질문에서 제안한 내용은 test 해보지 않았네요..

현 상태에서는 protease 분해도 아니고 계속 구조적 변성이 일어나고 있는것

같습니다.

참고로 protease에 의한 분해는 시료 내 단백질에 모두 비슷하게 일어나는 경향이

있습니다. 

앞다리졸업은언제하나  |  03.25 16:56  

저번에 말씀해 주셨던 부분은 먼저 두 가지를 말씀해주셨었는데요.

1. buffer를 tris buffer로 변경

2. 현 buffer로 실험할 경우 20mM Na-P buffer, NaCl은 빼고 투석

 

1. 제가 중간에 같은 실험을 다시한번 진행해서 동일한 결과를 얻는지 확인해보기위해 저번주 동안 실험을 하였기에 Trisbuffer로는 진행을 아직 하지 못 하였습니다. stock으로부터 다시 발현 정제를 진행하였음에도 같은 패턴의 band들을 확인하였습니다. 이번주부터 새로 발현이 들어갔기에 내일 정도에 진행이 되어 이번주 안으로 WB까지 확인이 가능할 것 같습니다. 

 

2. NaCl 부분은 학과내에 발현을 하는 연구실의 교수님과 회의를 하였는데, 저희 펩타이드의 solubility가 낮을 수 있어서 NaCl이 없으면 aggregation 문제가 발생할 것 같아 차선으로 미루었습니다.

현재 NaCl 농도를 변경시키는 것 보다는 buffer (sodium phosphate+NaCl->TrisHCl+NaCl buffer) 변경에 따른 변화를 먼저 보고 NaCl 농도를 변경해보는 순서로 진행될 것 같습니다.

NaCl 농도를 낮추거나 제거하는 부분에 있어서 조심스러운 이유는,
이번에 문제가 생기는 펩타이드 서열과 비슷한 이전 서열의 펩타이드에서도 (이전 서열의 마지막 서열과 His tag 사이에 몇가지 추가 서열을 삽입한 것) NaCl 농도가 낮아짐에 따라서 aggregation이 일어났었기 때문에 NaCl을 완전히 제거하는 것이 좀 조심스럽습니다. property calculation결과로 예상하기로는, 현재 문제가 생기는 펩타이드의 solubility가 더 낮고 (pI는 약 0.5 정도 높고, hydrophobic and neutral sequence composition은 비슷) 계산되기 때문에 salt에의한 침전이 또 다른 문제로 발생할 수 있을것 같다는 결론을 얻었습니다.

 

추가로 이온결합 크로마토그래피를 추천해주셨었는데,

저희 펩타이드 중 일부가 친화성크로마토그래피로 이용이 가능한 결합 부위가 존재하여 (His tag이 아닌), 친화성크로마토그래피를 계획 중에 있습니다.

일단 투석 후 filtration이 아닌, 원심분리로 상층액만 따서 쓰는 식으로 먼지를 제거 후 친화성크로마토그래피로 추가 정제를 들어갈 것 같습니다.

그런데 이것은 버퍼에 의한 변성이 일어나는지를 확인해야할 것 같아서, 50 mM sodium phosphate/300 mM NaCl (pH 8.0)로 준비했다가 대기상태입니다.

 

감사합니다!:D

대왕개구리SPEED  |  03.25 17:44  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 추가로 이온결합 크로마토그래피를 추천해주셨었는데,

: 이온결합이 아니라 이온교환컬럼입니다.

200개 이상의 단백질, 펩타이드를 정제해본 경험으로 본다면 일반적으로

NaCl이 용해도를 올려주는 경향이 있지만 아닌 경우도 많습니다.

더욱이 이온교환컬럼의 경우 buffer에 NaCl이 300mM 정도 들어 있으면

실험하기 곤란합니다.

 

앞다리졸업은언제하나  |  03.27 13:05  

안녕하세요, SPEED님.

ion exchange chromatography는 일단 변성되는 원인을 먼저 찾은 후, affinity chromatography로 정제가 되지 않는다면 진행될 것 같습니다.

말씀해주신대로 NaCl 농도는 300에서 150 mM정도로 낮춰도 응집이 생기지 않는지 확인 후에 낮춰서 진행해보도록 하겠습니다.

Tris buffer로 바꾼것은 아직 정제와 SDS-PAGE가 진행중이라서 오늘아니면 주말안으로 결과를 얻을 수 있을 것 같습니다 :D

 

좋은 결과로 말씀드릴 수 있길 바라고있습니다 ㅠㅠ

 

감사합니다^^

대왕개구리SPEED  |  03.27 13:19  

150mM로 줄여서는 다음 실험에 별 도움이 안될것 같습니다.

NaCl을 제거해서 test해보는것을 앞전 답변에서 추천드렸습니다.

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