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 전체 > Microbiology > Bacteria
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질문 plasmid prep. 관련 선배님들의 의견을 부탁드려요..
알팡이(대학원생)  |  03.25 09:06
첨부파일 파일첨부: Screenshot_20200325-090224_PowerPoint.jpg (223 KB)
이미지 첨부파일
안녕하세요~!

plasmid 연구를 이제 막 시작한 새내기 입니다. :-)

일반 wild type gram positive 혹은 negative bacteria에서 plasmid를 분리하고 있습니다.

사용하는 방법은 주로 gDNA isolation manual을 이용해서 gDNA와 plasmid DNA를 모두 추출 하고 있습니다.

mini prep을 진행하기도 하는데, manual로 진행후에 젤 전기영동을 해보면 밴드의 양상이 다르게 나타납니다.

첨부한 사진은 gDNA isolation manual로 진행한 결과인데 보시다시피 맨위에 gDNA 외에 아래에 뜬 밴드들을 plasmid라고 생각하고 있습니다. (사용한 마커는 linear DNA 마커입니다.)

그런데 mini prep을 진행하면 저렇게 밴드가 뜨지를 않네요....

plasmid가 아니라서 miniprep시에 추출이 되지 않는 것인지.. 무엇인지 잘 모르겠습니다.ㅠㅠ

선배님들의 의견 부탁드립니다.
#plasmid
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.25 09:32  

몇번 더 plasmid prep.을 진행해도 plasmid가 안나온다면 gDNA가 분리 중에

분해되어 나온 band일 가능성도 있습니다.

 

알팡이  |  03.25 10:40  
답변 감사드려요~~!

manual로 진행했을때 매번 여러개의 밴드가 함께 나옵니다.
대왕개구리강시  |  03.25 10:47  

그람양성균의 plasmid도 대장균 plasmid 분리방법을 준용하면 됩니다.

gDNA를 정제하면 보이던 plasmid(?) 밴드가 miniprep하면 안보인다면 linear plasmid일 수도 있습니다. 원래 linear 로 존재하는 plasmid가 그람 양성균에서 보고되거든요.

실험의 목적이 그냥 단순한 plasmid 분리라면 cell wall 분해에 신경 쓰시고 최대한 부드럽게, 특히 Sol 2, Sol3 단계를 부.드.럽.게 하세요. 그래야 gDNA 오염없이 깨끗하게 plasmid 분리가 될겁니다.

알팡이  |  03.25 20:40  

강시님, 바쁘신 시간 내주셔서 감사드립니다. ㅠ 몇가지 더 질문드려도 될까요...??

 

그람양성균의 plasmid도 대장균 plasmid 분리방법을 준용하면 됩니다.

-> 본문에서 말씀드린대로 그람양성균의 plasmid를 얻기 위해 mini prep 방법으로도 진행해보았습니다...만  gDNA를 분리하는 매뉴얼 방법으로 진행한 후에 나오는 전기영동 결과가 아예 다릅니다..

- mini prep. 으로는 아예 all no band

- 매뉴얼 프렙으로는 gDNA뿐 아니라 extra bands 확인

 

-> 만약에 plasmid로 추정하는 밴드가 linear의 형태라면... mini prep.시에

denaturation buffer에 의해서 변성되어 젤 상에서 결과를 볼 수 없었던 것은.. 아닐지도 한 번 생각이 듭니다...

 

gDNA를 정제하면 보이던 plasmid(?) 밴드가 miniprep하면 안보인다면 linear plasmid일 수도 있습니다. 원래 linear 로 존재하는 plasmid가 그람 양성균에서 보고되거든요.

-> 말씀해주신 부분에 대해 여러 페이퍼들이나 자료들을 찾아보았습니다.

우선 제가 진행하고 있는 균주에서 linear plasmid가 나온다는 내용은 없었습니다.; (원래 플라스미드가 없다고 알려져?있는 균주이긴 합니다.)

linear plasmid일 수도 있다고 하신 부분에 대해 저도 그렇게 믿고 싶은 이유가 있는데, 예전에 저 위에 전기영동의 결과를 얻고,

"gDNA (linear DNA) + extra bands (plasmid라 추정, circular form) "의 상태에서

exonuclease 처리를 통해 linear DNA만 선택적으로 제거해보려고 진행한 적이 있었습니다.

결과는 모든 밴드가 다 사라졌어요... 그래서 당시에 몇 번 반복해서 진행해보다가 결과가 계속해서 동일하게 나왔었는데 제가 효소를 잘못 구매한 것인가 생각했었습니다.

근데 gDNA 외에 다른 밴드가 linear의 형태라면... exonuclease 처리에 의해 모두 없어졌을 수도 있겠다는 생각이 듭니다..

 

답답한 마음에 좀 길게 적어보았습니다.......ㅜㅜ

 

감사합니다. ^^

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