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레벨5
imperialvet
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20.03.24 17:13
formaldehyde 혹은 parformaldehyde는 green image에서 autofluorescence를 일으킵니다. 파라핀 섹션 하셨다고 하면, 위 고정제(fixative)를 사용하셨을 것으로 추측되는데, 상기 파장을 타겟하는 형광염색된 세포를 피하 투여하셨다면, formaldehyde 혹은 parformaldehyde에 고정 없이 동결 후 동결절편 한 뒤 알코올 혹은 메탄올로 고정하셨어야 했을 것으로 보입니다.
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레벨4
him
(과기인)
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20.03.25 11:19
질문자입니다.
그러면 PFA로 고정하고 paraffin section 한 샘플로 형광안티바디를 염색해서 보려면 애초에 고정방식을 다르게 했어야 하는건가요?
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레벨5
imperialvet
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20.03.25 18:15
제 짧은 식견으로는 그렇습니다. 물론, 상기 언급하신 파장대를 제외한 곳에서는 괜찮을 수 있다고는 알고 있으나, 기억이 확실치는 않습니다. paraformaldehyde를 이용하여 고정한 장기에서 1, 2차 항체를 이용하여 IF를 수행할 때 autofluorescence를 없애는 과정을 IF 중간에 추가하면, paraformaldehyde에 의한 autofluorescence를 제거 할 수 있다고는 알고 있습니다.
하지만, 선생님께서 실험 중인 모델에서는 조직에서 이 과정을 할 경우, 이미 형광염색된 세포의 형광 발현도 제거하기 때문에, methanol or ethanol 고정이 필요하다고 말씀 드린 것입니다.
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레벨4
him
(과기인)
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20.03.26 13:13
질문자입니다.
밀리포어꺼 Autofluorescence Eliminator Reagent for IHC가 있던데 이거를 IF 과정 중간에 쓰면 될까요?
그리고 PFA 고정에 의한 autofluorescence라면 methanol 또는 ethanol로 고정 시 후에 cryo가 아닌 paraffin으로 해도 되는건가요?
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레벨5
imperialvet
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20.03.27 11:55
PFA에 의한 autofluorescence를 제거하기 위한 agent를 사용하면 제거 되겠지만, 이미 선생님께서 투여한 세포의 fluorscence도 제거될 것이라는 것을 인지하셔야 할 것으로 판단됩니다.
그리고 유감스럽게도 methanol이나 ethanol 고정 후, paraffin 엠베딩 해본 경험이나 관련 지식은 저에겐 없습니다....