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질문 confocal 시에 형광이 전반적으로 보이는 이유
뒷다리him(과기인)  |  03.24 16:20

in vivo에 형광염색된 세포 (PKH67, excitation 490nm, emission 502 nm)를 subcutaneous injection 하였습니다.

그리고 한달 후에 조직 paraffin section을 하고 xylene - rehydration 과정 후에 mounting media with DAPI를 처리 한 후에 confocal로 확인을 했는데요,

green image (alexa488로 설정)가 injection한 부위 말고 조직 전체적으로 보이더라구요..

실험과정에 문제가있는건지.. 왜그런지 이유를 알 수 있을까요?

 

  

#PKH67
 
#confocal
 
LABox #Fluorescence
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이imperialvet  |  03.24 17:13  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

formaldehyde 혹은 parformaldehyde는 green image에서 autofluorescence를 일으킵니다. 파라핀 섹션 하셨다고 하면, 위 고정제(fixative)를 사용하셨을 것으로 추측되는데, 상기 파장을 타겟하는 형광염색된 세포를 피하 투여하셨다면, formaldehyde 혹은 parformaldehyde에 고정 없이 동결 후 동결절편 한 뒤 알코올 혹은 메탄올로 고정하셨어야 했을 것으로 보입니다. 

뒷다리him  |  03.25 11:19  

질문자입니다.

그러면 PFA로 고정하고 paraffin section 한 샘플로 형광안티바디를 염색해서 보려면 애초에 고정방식을 다르게 했어야 하는건가요?

 

올챙이imperialvet  |  03.25 18:15  

제 짧은 식견으로는 그렇습니다. 물론, 상기 언급하신 파장대를 제외한 곳에서는 괜찮을 수 있다고는 알고 있으나, 기억이 확실치는 않습니다. paraformaldehyde를 이용하여 고정한 장기에서 1, 2차 항체를 이용하여 IF를 수행할 때 autofluorescence를 없애는 과정을 IF 중간에 추가하면, paraformaldehyde에 의한 autofluorescence를 제거 할 수 있다고는 알고 있습니다.

하지만, 선생님께서 실험 중인 모델에서는 조직에서 이 과정을 할 경우, 이미 형광염색된 세포의 형광 발현도 제거하기 때문에, methanol or ethanol 고정이 필요하다고 말씀 드린 것입니다.

뒷다리him  |  03.26 13:13  

질문자입니다.

밀리포어꺼 Autofluorescence Eliminator Reagent for IHC가 있던데 이거를 IF 과정 중간에 쓰면 될까요? 

그리고 PFA 고정에 의한 autofluorescence라면 methanol 또는 ethanol로 고정 시 후에 cryo가 아닌 paraffin으로 해도 되는건가요?

올챙이imperialvet  |  03.27 11:55  

PFA에 의한 autofluorescence를 제거하기 위한 agent를 사용하면 제거 되겠지만, 이미 선생님께서 투여한 세포의 fluorscence도 제거될 것이라는 것을 인지하셔야 할 것으로 판단됩니다.

그리고 유감스럽게도 methanol이나 ethanol 고정 후, paraffin 엠베딩 해본 경험이나 관련 지식은 저에겐 없습니다....

 

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