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질문 western blot 실험 중 b-actin을 제외한 다른 band가 나오지 않습니다
올챙이juyu21(대학원생)  |  03.24 13:31
첨부파일 파일첨부: b-actin.png (63 KB)
이미지 첨부파일

western blot 실험 중 b-actin을 제외한 다른 band가 나오지 않습니다.

protein은 300 ug/lane 씩 로딩하고 있습니다

SDS-PAGE gel을 만들었으며, (5% stacking gel + 10% running gel)

1.0 mm 두께의 lane을 사용했습니다.

1st antibody, 1:1000, 4도씨, overnight, santacruz, sc-365498, sc-293072

2nd antibody, 1:2000, RT, 1 h, Jackson immuno research, 115-035-003

PVDF membrane을 사용합니다

detection은 1 min 했습니다.

 

문제는 detection을 하면 b-actin은 정말 두껍게 나오는데 

그 외 다른 band는 나타나지 않습니다. 

혹시 몰라서 1st Ab를 48 h까지 붙여도 보았으나 여전히 나오지 않습니다

이런 경우는 처음이라 당혹스럽습니다

도대체 무엇이 문제인지 파악하기가 어렵습니다

b-actin사진도 함께 첨부합니다.

#western blot
 
#band
 
#antibody
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대왕개구리SPEED  |  03.24 14:10  

1. actin band도 양이 들쭉날쭉합니다.

sample 정량 및 loading을 좀더 정확히 해야 할것 같습니다.

2. 300ug/well이 아니라 30ug/well이 아닌가요?

3. 두가지 sample의 develope된 film도 올려주세요.

film이 어떤 상태인지 봐야지 원인을 찾는데 도움이될것 같습니다.

4. Dot blot은 안해봤나요?

올챙이juyu21  |  03.24 14:49  
첨부파일 파일첨부: 그림1.png (97 KB)
이미지 첨부파일

1. sample 정량 다시 하겠습니다.

2. 300 ug/well 맞습니다. 혹시 너무 많은 건가요?

3. 질문에 올렸던 그림이 sc-365489와 b-actin을 붙였을 때의 그림입니다. 동일한 antibody로 실험한 다른 film도 첨부합니다. b-actin을 기준으로 위쪽에 다른 band가 있어야 하는데 나타나지 않았습니다. 

 4. 해보지 않았습니다.

대왕개구리SPEED  |  03.24 14:56  

300ug이 안나왔을건데.. 실제 300ug이라면 상당히 많은 양입니다.

첨부 film을 보면 actin과 target을 보기해서 membrane을 잘라서 하지 않았나요?

동시에 2가지 항체로 붙였나요?

dot blot을 먼저 해보는 것이 방법도 간단하고 원인을 확인하는데 좋을 듯합니다.

 

올챙이juyu21  |  03.24 14:58  

memebrane을 잘라서 detection 할때 film 크기에 맞게 나열하여 detection하였습니다.

대왕개구리SPEED  |  03.24 15:08  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

membrane이 지저분한데 이정도면 비특이 band라도 나와야 하는데 target

band쪽은 아무런 band도 안나왔네요.

항체도 찾아봤는데 mouse 1st ab, anti-mouse 2nd ab로 별 문제가 없는것 같구요.

sample에 ag가 있는지 WBT으로 다시 확인 또는 dot blot으로 확인해 봐야

할것 같습니다.

band가 조금이라도 나와야지 blotting 조건을 최적화해보는데 아무런 band가

안나오면 ag부터 확인을 해보세요.

그리고 1st ab는 4도 13~16시간, 실온 1~3시간으로 충분하니 그 이상은

할 필요가 없습니다.

dd  |  03.25 12:19   

300ug 은 너무 많은 양 아닌가요...? 근데 300ug 이 맞나요? 300ug 로딩 했으면 액틴 밴드가 분리가 안될정도로 떡져서 보이는게 정상일거같은데... 제가 10ug 정도 로딩하는게 저거 절반정도 되거든요..

웨스턴이싫어  |  03.27 10:58   

저는 아예 b-actin도 안나오던때도 있었습니다...ㅎㅎ

그거에 비하면 님은 b-actin은 나와서 다행이네요..

우선 농도가 너무 높다고 봅니다

보통 잘 나오는것(b-actin같은 housekeeping gene들)들은

심지어 5ug일때도 나오기도 합니다

농도계산부터 재확인이 필요하다 봅니다(주변분께 도움을 청합시다)

 

전 살짝 다르게 접근하자면 우선 b-actin은 나온다는 점에 집중해봤습니다

이는 전체적인 과정(protein 추출, 정량(이는 아마 피펫 취급오류정도의 실수),running,transfer,blocking,1`st,2`st,ecl처리)는 우선 되었다는 뜻인데

그러면 b-actin과의 차이점 위주로 생각을 해보시면 어떤가요?

protein은 동일한 것을 사용하였을테니 그건 제외하고

항체 자체를 datasheet부터 다시 출력하여 기본적인 항원항체

반응률,항체 사용가능실험종류,항체의 종류(단일항체같은 표현),그리고

host의 확인등을 재 확인하시면서 틀린점이 있나 확인하는겁니다

아니면 그냥 항체를 옆실험실에서 빌려 사용해버리는것도 방법이죠

 

그리고 일반적인 western 확인중 ponseau s로 transfer 확인을 하는것도 있습니다

그걸로 각 lane이 membrane에 넘어갔는지를 확인할수 있죠

 

그리고 제일 무식한 방법으로 결코 결과로 사용을 못하지만 지금같은 경우

마지막에 사용하는방법으로 detection과정중 노출을 o/n으로 하는겁니다

밤새 노출하면 다른 lane의 protein들이 나올수도 있습니다

아마그건 농도가 선생님조건에서 작았다던가 항체가 오래된거라던가등의

문제로 보고 고쳐나가는 방법이 될수 있겠죠.

 

최대한 하나씩 고쳐나가면서 반복하면 분명 나올거라 보여지니

잘 찾아보시기 바랍니다.

 

 

 

 

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