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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 pfu pcr 시 작은 밴드가 더 안나옵니다.
올챙이뜌뜌(대학생)  | 03.24 12:41

클로닝 후 시퀀싱 하기 위해 Pfu로 pcr을 진행하고 있습니다.

목표로 하는 사이즈는 500bp, 1200bp, 1600bp 세 개의 밴드인데

회사에서 제공하는 메뉴얼 대로 pcr을 하면 1000bp 이상의 밴드는 뜨는데 오히려 500bp 짜리 비교적 작은 사이즈의 밴드는 뜨질 않습니다,,

게다가 나온 밴드들도 multi여서 지저분합니다.

단순 프라이머의 문제인가요?

프라이머 문제라기엔 taq으로 했을 때 500bp가 나왔는데, 큰 사이즈의 밴드는 또 안나와서...

 

조건은 template cDNA 200ng에

94도 51분 (94도 30초 - 54도 30초 - 72도 2분)x37 72도 7분  입니다.

 

#pcr
 
#pfu
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리CHINyo76_philekorea  |  03.24 13:20  

언급하신것을 보면 polymerase나 primer 자체의 문제는 아닐것으로 생각됩니다.

그런데 cloning이 되었다면 target이 포함된 plasmid를 바로 sequencing 의뢰하시면 안되나요?

그리고 밴드가 target만 specific하지 않다면 annealing temp를 올려보셔서 확인할 필요가 있고, MCS 내에 target fragment가 있다면 enzyme restriction 후 전기영동을 통해 확인하실 필요도 있을것 같습니다.

 

올챙이뜌뜌  |  03.24 13:53  

제가 헷갈리게 질문을 올렸습니다.

아직 클로닝 전단계입니다..!!

pcr 후에 클로닝과 시퀀싱을 진행하려 합니다.

플라스미드에 넣을 insert를 만들어야 하는데 밴드가 나오질 않아서요..

대왕개구리SPEED  |  03.24 14:12  

target이 3개인데 PCR은 한가지 조건으로 했나요?

개별 gene에 대한 PCR 조건을 찾아 보세요.

아니면 일반 taq으로 증폭해도 error rate가 낮습니다.

염기서열 분석시 1개 gene에 대하여 3개 정도 의뢰하면 충분히 error 없는

gene의 확인이 가능합니다. 

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