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 전체 > Microbiology > Bacteria
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질문 4 % paraformaldehyde 고정시
알지민쨩(대학생)  |  03.24 08:28

제가 형광염색약인 SYBR gold를 이용하여 bacteria 와 bacteriophage를 염색 한 후 형광현미경으로 관찰하려고 합니다. 논문에서는 4 % paraformaldehyde로 고정 후 관찰한다. 이렇게만 적혀있는데 고정하는 자세한 과정을 알 수 있을까요 ? ㅜㅜ 

#형광염색
 
#박테리아
 
#박테리오파지
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리Favorite  |  03.24 09:10  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
4% PFA의 퀄리티가 우선 중요합니다. 오래된것 사용하시면 안좋습니다. 시료에 물기를 최대한 제거하자마자 시료에 다 도포 되도록 뿌리거나, 세포의 경우 센트리퓨즈로 세포를 1.5ml튜브 안에서 다운시키고 상층의 액체를 조심히 제거 한뒤 4%PFA를 넣습니다. 4도에서 반응시키거나 상온에서 반응시키기도하는데 세포같으며누저같으면 4도 냉장고에서 하겠습니다. 그냥 두면되는데 문제는 시간입니다. 짧게 10분 길게 1시간 더길게는 몇시간에서 하루 두기도 합니다. 세포나 조직의 크기 두께 양에 비래하며 양이 작다면 10~20분이면 충분합니다. 너무 오래두면 overfixation이라고해서 안좋아요. 그뒤 pbs등의 버퍼로 잔존 pfa를제거해주면됩니다. 헹궈주라는겁니다. 방법은 역시 도포형태나 담구었다빼거나 센트리퓨즈를 이용하여 상층액 제거방식을 하면되겠습니다. 시료가 손상되지않는 범위에서 완벽히 제거해주길 권장합니다. 최소 3번.
알지민쨩  |  03.25 09:41  

세포가 아닌 형광을 염색시킨 일반 bacteria 나 바이러스인 bacteriophage를 고정하려고 하면 어떻게 해야하나요? 똑같이 원심분리하여 얻어진 pellet에 고정액을 넣으면 pellet이 풀리지 않나요? 

개구리Favorite  |  03.25 22:31  
펠렛을 살살 잘풀어서 모든 세포가 노출이 잘되게 하시고 다시 원심분리하여 상층액을 따내면 되지요.
BU  |  03.26 01:04   

박테리아 쪽은 잘 모르겠지만, 그걸 왜 펠렛으로 만든다는 것이지 (고정하려고) 이해가 잘 안되네요.

 

세포를 고정할 때 흔히 쓰는 법을 말씀 드릴께요.

Think in reverse order:

1. How to visualize the cell under fluorescent microscope?

a. glass slide 

b. culture dish (petri dish)

- before cell culture, place "coverslip" at the bottom of the petri dish.

- culture cells on top of the coverslip within a petridish or flask

- by the time of fluorescent immunocytochemistry:

-- Wash cell culture dish with PBS

-- Fix at 4 % PFA at 4 C overnight or Room temp. for 1 hr

-- Contiue staining with antibodies or if you do not need antibody stain, place the coverslip in which cells reside into one glass slide. 

-- Mount with the second coverslip with mounting medium.

-- Image under microscope.

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