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 전체 > Immunology > Antibody
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질문 western blot 실험 중 b-actin을 제외한 다른 band가 나오지 않습니다
올챙이juyu21(대학원생)  |  03.22 16:52

현재 western blot 결과가 나오지 않아 고생하고 있는 대학원생 입니다

원래 생물학이 주전공이 아니라 더 힘든것 같습니다

protein은 300 ug/lane 씩 로딩하고 있습니다

1st Ab는 1:1000으로 희석해 4도씨에서 overnight

2nd Ab는 1:1000으로 희석해 실온에서 1 h

PVDF membrane을 사용합니다

문제는 detection을 하면 b-actin은 정말 두껍게 나오는데 

그 외 다른 band는 나타나지 않습니다. 

혹시 몰라서 1st Ab를 48 h까지 붙여도 보았으나 여전히 나오지 않습니다

이런 경우는 처음이라 당혹스럽습니다

도대체 무엇이 문제인지 파악하기가 어렵습니다

#western blot
 
#band
 
#detection
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알Panggn  |  03.22 18:18  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

일단 beta-actin은 detection이 된다는 것은 westernblot protocol 자체는 문제가 없다는 것으로 생각됩니다. 그렇다면 detection 하고자 하는 protein과 사용하신 primary antibody가 잘못 match됐거나 reagent 자체에 문제가 있는 것 같습니다. tag을 통해 detection하시는 거라면 tag 여부를 다시 한 번 확인해 보시고, positive control 등을 같이 걸어서 primary antibody의 binding 여부를 다시 확인해 보세요. 전부 이상이 없다면 antibody에 문제가 있을 가능성이 높습니다. 

올챙이juyu21  |  03.22 22:22  

현재 실험실에서 western blot을 하는 사람이 저 혼자 밖에 없어서

positive control을 걸만한게 없습니다. 말씀하신대로 primary antibody 문제라면

혹시 다른 방법으로 찾을 수는 없을까요?

개구리Q.E.D.  |  03.22 22:50  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
우선 사용하는 1, 2차 항체의
회사와 카탈로그 넘버를 올려주세요

그리고 2차 항체의 농도는 1차보다 낮아야 하며
웰당 걸 수 있는 단백질 농도가 있습니다

겔 종류와 lane 두께 그리고 b-actin
사진도 첨부 부탁합니다

그래야 보다 정확한 답변을 얻을 수 있습니다^^
올챙이juyu21  |  03.23 15:16  
첨부파일 파일첨부: b-actin.png (63 KB)
이미지 첨부파일

말씀하신 b-actin사진 첨부합니다.

조건은 아래와 같습니다.

SDS-PAGE gel을 만들었으며, (5% stacking gel + 10% running gel)

1.0 mm 두께의 lane을 사용했습니다.

1st antibody, 1:1000, santacruz, sc-365498, 

2nd antibody, 1:2000, Jackson immuno research, sc-2005

detection은 1 min 했습니다.

지나다가  |  03.25 13:17   

2차 항체를 mouse, rabbit....  제대로  붙이신건 맞는지 한번 확인 해보셨는지요..?

단백질 사이즈는 어떻게 되나요?

너무 큰 사이즈면 gel  % 를 낮춰서 전기영동후 transfer 해보시길 추천드려요

(10 %면 웬만한 사이즈는 약하게라도 다 나오긴 하겠지만....)

 

 

 

 |  03.27 16:26   

1차 항체 희석율을 좀 더 낮춰보시는 것도 추천드립니다. 데이터시트 상에 보면 웨스턴 항체 농도가 이렇게 쓰여 있으니 -> (1:100 ~ 1:1000) 1:500~1000 사이로 희석해보시면 더 잘 나올수도 있을 것 같네요. 대신 농도가 너무 높으면 블랏이 더럽게 나올 수도 있으니 주의하시구요.

 

만약 그래도 안나오면 detection 시간을 좀 더 길게 해보시는 거나 detection 액 농도가 높은 제품을 사용해보시는 것도 추천드립니다. 

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