[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
물리적 거리두기 실천
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
LABox-과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
조회 422  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 4개 insert DNA cloning 진행중인데,,,cloning 노하우 알려주시면 감사하겠습니다,,
알헛둘(대학원생)  |  03.21 21:46
첨부파일 파일첨부: 그림1.png (303 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요,

현재 4개 insert DNA를 넣는 cloning 진행중인데,, 잘 되지 않습니다.

insert 1 - 453bp (Xho1/EcoR1)

insert 2 - 462bp (EcoR1/BamH1)

insert 3 - 492bp (BamH1/Not1)

insert 4 - 397bp (Not1/Sap1)

pBluescript II SK(+) vector - 약 2592bp(Xho1/Sap1)

 

1. insert 2개씩 ligation후 PCR

vector에 하나씩 insert넣기 전에 두개씩 insert 1+insert 2 / insert 3+insert 4 ligation 해서, PCR해서 두개씩 붙인 insert 만들어 주고,

이후에 (insert 1+insert 2) + (insert 3+insert 4) 이렇게 4개 모두 insert 들 끼리 다 ligation 해준 후 vector에 넣어주려고 하고 있습니다..

각 각 insert들 75ng 기준으로 하여 1 : 1 로 계산하여,,

NEB T4 ligase로 16도 over night으로 반응 시켰습니다.

이후 각각 프라이머를 이용해서 PCR을 진행했는데,, PCR이 되지 않았습니다,

pcr 조건: 95 - 2m / 95 - 20s / 55or60 - 40s / 72 - 1m 30s / 72 - 5m (35cycle)

현재 저의 생각에는 Ligation이 안된것 같은데,,,size 도 안맞고,, 어떻게 하면 insert끼지 ligation을 잘 시켜줄 수 있을까요?? (사진 첨부 합니다..)

 

2. insert 2개씩 or 3개 or 4개 나/ insert 4개와 vector을 한꺼번에 ligation

혹시 insert 2개씩 or 3개 or 4개 나/ insert 4개와 vector을 한꺼번에 ligation시켜주는 것이 가능한가요?? (NEB T4 Ligase를 이용해서,,,)

제가 찾아본 바로는 insert 2개씩와 vector을 한꺼번에 ligation 하는 방법이 있고, 성공했다고 하는데,, 어떻게 생각하시나요,,?

어떤 분들은 확률이 매우 떨어진다고도 하고,,

golden gate cloning 방법을 이용해서 하면 될 것도 같은데, 다른점이 있다면 저의 경우에는 type 1 enzyme을 이용해서 일단 각각의 DNA feagment들을 만들어 줬다는 겁니다,,,,

T4 ligase의 효율이 좋지 않을까요??

 

이와 관련되서 조언을 주시거나, 참고 할 만한 문헌 주시면 공부 해보겠습니다..!

미리 감사드립니다,,

#cloning
 
#4 insert
답변하기
검색광고 검색광고
[에펜도르프코리아] Eppendorf PCR장비,Thermal Cycler
새로운 Mastercycler X50은 식품 테스트 등 정기적인 PCR 실험의 표준화와 연구 PCR 실험을 위해 속도, 유연성 및 PCR 최적화가 결합된 솔루션입니다.제품문의:1577-4395
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.21 22:10  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

4개의 gene의 단순 cloning이라면 1개씩 넣는 것이 가장 편할것 같습니다.

4번의 clonig으로 시간이 많이 걸릴것 같지만 기본적인 방법을 따라하는 것이

가장 좋을 때도 있습니다.

그 다음은 1+2, 3+4를 만들어서 2번의 cloning으로 진행하는 방법입니다.

PCR로 연결하는 방법도 있지만 band를 elution해야합니다.

elution 할것 같으면 1+2, 3+4을 ligation 후 gel에서 바로 elution해서 cloning에

사용하는 것이 좋을 듯 합니다.

한번이라도 더 PCR하면 base error도 생길 가능성이 높기 때문입니다.

정리하면

1. 4개의 gene을 한번에 한개씩 cloning.

2. 1+2, 3+4를 in vitro ligation 후 target gene elution 및 2회 cloning

위의 2가지 방법이 좋지 않을까 합니다.

첨부 사진에서 1+2, 3+4의 분자량이 5kb 부근이 왜 나오나요?

알헛둘  |  03.21 22:25  

먼저 빠른 답변 감사합니다,,

일단은 조언해 주신것과 같이 Ligation한거 gel에 내려서 다시 한번 PCR 해보도록 하겠습니다,,

저도 왜 첨부 사진에서 1+2, 3+4의 분자량이 5kb 부근에서 나오는지 모르겠습니다...

저의 생각에는 ligation이 잘 안되서 다른 DNA에 Primer가 붙어서 해당하는 band가 나온것이 아닌가 생각됩니다..

혹시 2번째 방법을 사용하여 2개의 fragmet 끼리 ligation 시킬 때, 각각 75ng씩 1: 1로 반응시켜서 ligation하는거는 충분한가요?? 아니면 조금 다르게 해줘야 할까요??

대왕개구리SPEED  |  03.21 22:41  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 일단은 조언해 주신것과 같이 Ligation한거 gel에 내려서 다시 한번 PCR

해보도록 하겠습니다,,

: 1+2, 3+4를 ligation한 sample을 전기영동 해서 gel elution 후 PCR하지 말고

바로 ligation에 사용하세요.

2. 저의 생각에는 ligation이 잘 안되서 다른 DNA에 Primer가 붙어서 해당하는

band가 나온것이 아닌가 생각됩니다..

: 시료 중에 5kb가 나올 template가 없는것 같습니다.

3. 혹시 2번째 방법을 사용하여 2개의 fragmet 끼리 ligation 시킬 때, 각각 75ng씩

1: 1로 반응시켜서 ligation하는거는 충분한가요?? 아니면 조금 다르게 해줘야

할까요??

: 1+2, 3+4 두 경우 모두 각 단편의 비율은 무게 비율이 아닌 몰비율 1 : 1로

해야 하며 ligation된 band만 elution해서 사용하려면 ligation 효율, elution 효율

을 감안할 때 각 150 ~200ng 정도는 하는것이 좋을 듯합니다.

A) 1+2의 1 : 1 몰비율 ligation

1 : 200ng

2 : 약 196ng

B) 3+4의 1 : 1 몰비율 ligaion

3 : 200ng

4 : 248ng

알헛둘  |  03.21 22:56  

답변 정말 감사합니다,,,!!!

조언해 주신 대로 한번 진행해 보도록 하겠습니다,,,

 

마지막으로 질문이 있는데, ligation 진행해주는 조건이

DNA fragmet 1&2 : 몰 수 비율적으로 1:1

NEB T4 ligase buffer : 2ug

NEB T4 ligase : 2ug

dw

total 20ug reaction으로 16도 over night으로 진행해도 괜찮을까요?

혹시나, T4 ligase양을 늘려줘야 할까봐 여쭤봅니다,,

 

아참,, 제가 첨부파일에 gel 사진 marking 실수를 했는데, 저기는 5000bp가 아니라 500bp입니다,,ㅎㅎ

대왕개구리SPEED  |  03.21 23:25  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
ug이 아니라 ul입니다.
ligase는 2ul로 충분합니다.
반응은 4도 o/n 또는 16도 3시간이면되고
절대 16도 o/n은 하지마세요.
알헛둘  |  03.21 23:48  

네,, 알겠습니다,, ug-->ul로 정정합니다,,

조언해 주신거 참고하여 실험 진행해 보도록 하겠습니다

답변해주셔서 감사합니다,,!!!
행복한 주말 보내세요!!

개구리순똘  |  03.22 10:00  

Golden gate cloning이나 질문자님의 실험방법으로도 원하는 결과를 얻을 수 있지만 더 쉽고 좋은 방법 알려드립니다.

https://journals.plos.org/plosone/article/figure?id=10.1371/journal.pone.0026875.g001 Overlap PCR 입니다. overlap PCR은 잘만 사용하면, mutation, insertion, deletion 등 다양하게 응용 가능합니다. Kit 구매 필요없고, primer design만 잘하신 뒤 PCR만 하시면 됩니다. (google 검색해도 많이 나오고, 제가 link 건 논문의 Figure1A를 보세요. Figure1A를 보면 third PCR까지 있지만, second PCR까지만 보시면 됩니다.)

1st PCR) Insert 1-4를 먼저 pcr로 증폭시킵니다. (필수는 아니나, 1st PCR의 primer가 2nd PCR의 효율을 낮출 수 있으므로, purification 하면 좋습니다.)

2nd PCR) 증폭된 insert 1과 insert 2를 하나의 tube에 넣고 다시 pcr을 합니다. insert 3과 insert 4도 마찬가지. (마찬가지로, 필수는 아니나 purification 하면 좋습니다.)

3rd PCR) 증폭된 Insert1-2와 Insert3-4를 하나의 tube에 넣고 다시 pcr을 합니다.

* 1st PCR의 Insert 1 ~ 4를 한번에 넣고, 2nd PCR을 돌려도 이론적으로 가능은 하나, 제가 해본적이 없어서..

* 주의사항은 PCR시 mutation이 계속 누적되기 때문에, cycle을 잘 조절해야 합니다. 누적 PCR cycle로 관리를 하시면 됩니다. 사용하실 PCR enzyme의 error rate과, 증폭될 유전자의 길이, final pcr product에서 mutation이 하나도 없는 pcr product의 희망하는 비율등을 고려하셔서 누적 cycle을 결정하시면 됩니다. 계산식을 글로 설명하긴 어렵고, 450bp가 4개이고, 총 1800bp 정도 되니까 30 cycle 미만으로 하시길 바랍니다.

* 노하우를 알려드리면, 1st PCR을 15-25 cycle로 증폭시키고, purification 진행합니다. 그 후, 1st PCR product를 소량만 넣는것이 아니라 통째로 넣어서 2nd PCR 5-15 cycle을 진행합니다. 3rd PCR까지 하실거라면, 2nd PCR purification 후, 통째로 넣고 3rd PCR 진행하시고, cycle은 누적 30 cycle이 되도록 조절하시면 됩니다.

개구리순똘  |  03.22 12:49  

ligation 후 pcr 했을 때, 대략 900 bp쯤에 band가 생겨야 하는데, 안생기는 이유는 설명주신 내용만으로는 알기 어렵네요.

질문자님께서 올려주신 그림파일에는, 조건마다 lane이 두개씩인데, 두번 반복실험하신건가요? 조건이 다른건가요?

그리고 500bp (5000bp로 오타난) 쯤에 있는 밴드들은 (ligation 후) pcr 하기전에는 없었다가, pcr해서 생긴 밴드인지, pcr 하기 전부터 있었던 band인지 확인이 필요해보입니다.

그리고 이건 질문에 대한 답은 될 수 없지만, insert 끼리 ligation을 할 때, 양쪽을 다 enzyme cut 하시면 안됩니다. 예를 들면, insert1과 insert2를 EcoR1으로만 enzyme cut한 후 ligation을 하셔야 합니다. EcoR1으로만 잘라도,

insert1-insert1, insert1-insert2, insert2-insert2 로 ligation이 될 수 있어 효율이 1/3인데, bamH1과 Xho1으로도 잘라버리시면, ligation이 무한히 가능해집니다..

알lpg2314  |  03.22 16:04  

Overlap PCR과 유사한데, Gibson을 쓰셔도 될 것 같습니다. NEB에서 구매할 수 있는 

NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix 로 간편하게 가능합니다. overlap region (25~40 bp, Tm >55)로 해서 50C에서 30분만 incubation하면 3~4개 insert 쉽게 들어갑니다.

vector의 경우, restriction enzyme으로 자른 것을 그대로 쓸 수 있습니다. 

ivui13  |  03.23 14:09   
첨부파일 파일첨부: 그림2.png (351 KB)
이미지 첨부파일

@ 순똘님! 위에 분이 말씀해 주신 대로 실험을 하고 있어서, 이제야 bric에 돌아와서 봤네요,, 먼저 답변해 주셔서 감사합니다...!

1. 질문자님께서 올려주신 그림파일에는, 조건마다 lane이 두개씩인데, 두번 반복실험하신건가요? 조건이 다른건가요?

--> 첫번째 세트는 mouse gene을 넣었고, 두번째 세트는 human gene을 넣어서 다른 시료 입니다,, 하지만 두개의 gene을 같은 벡터에 넣어 주었기 때문에 자르는 사이트랑 크기는 동일 합니다. 따라서 gene insert(약 100bp)이외에는 같습니다,,

2. 500bp (5000bp로 오타난) 쯤에 있는 밴드들은 (ligation 후) pcr 하기전에는 없었다가, pcr해서 생긴 밴드인지, pcr 하기 전부터 있었던 band인지 확인이 필요해보입니다.

-->ligation 후 500bp 쯤에 있는 밴드들은 pcr 하기 전부터 있었던 band인것 같습니다. ligation 하고난 후의 sample을 gel loading을 했더니 multi band 가 나타났습니다,,,(첨부 파일에 gel 사진 있습니다.)

3. insert 끼리 ligation을 할 때, 양쪽을 다 enzyme cut 을 해서 진행을 했습니다,,, 이래서 안됐을 수도 있겠네요,,,, 효율이 매우 낮을 수도 있겠습니다,,,,ㅜㅜ

주변분들에게 물어 봤을때 overlap PCR은 잘 안됐다고 말씀해 주셔서,,, 시도를 안해봤네요,,,

사실 이전에 golden gate cloning을 해서 시도를 해봤었는데, 저희 sample에 있는 scaffold 부분이 무슨이유인지 모르겠지만 sequencing이 안되네요,,ㅜㅜ(gene이 들어간거는 확인을 했습니다.) 2차구조 문제인지, 아니면 scaffold 부분이 문제인지를  모르겠어서,, cloning을 다시 진행하고 있습니다,,,

지금 제가 가지고 있는 조건에서 type2 enzyme을 사용하지 않고, type1 enzyme을 이용해 다 짤라준 후에도 사용 가능 한지를 모르겠어서, golden gate cloning방법은 접어뒀습니다,,, 혹시 지금 상황에서 golden gate cloning사용 가능한가요,,,?

ivui13  |  03.23 14:19   

@ lpg2314님 답변해 주셔서 감사합니다.

앞서 말씀 드린대로 gloden gate cloning이 실패한 후, NEB Gibson Assembly Master Mix를 이용해 Gibson cloning을 진행하려고 했는데,,,

일단 랩실에서 해본 분이 없어서 제가 처음 시도하는 상황고 될지 안될지 모르는 상황이여서,, 시도를 안했습니다,,ㅜ

그리고 Gibson Assembly 프라이머를 프로그램( NEBulder, snap gene, benchling)을 이용해서 짜봤습니다.

각 프로그램마다 프라이머 디자인 해주는 방법이 조금씩 다른 것 같은데 잘 모르겠고,, 제가 넣어주는 insert 4개의 동일한 sequence들이 많다보니까, snap gene 프로그램을 이용해서 짜쭸을때 1-2개의 프라이머에 5-7 bp 정도 동일하게 붙는 부분이 있었습니다,,, 

이렇게 될 경우 프라이머가 붙는데 효율이 떨어질 것 같고, 5개 정도의 fragmet일때 효율이 떨어질 것도 같아서, 접었습니다,,ㅎㅜㅜ

 

답변하기
할인행사 광고 검색광고
케이비티 케이비티
Stirrer, Dry Bath, Shaking Incubator, Thermo Shaker 등 다양한 제품.. (6.31까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
5/6  좌우
195,700186,000
154,700147,000
121,800115,800
60,70057,700
55,70053,000
111,900106,400
80,40076,400
272,100258,500
126,900120,600
139,400132,500
111,300105,800
50,40047,900
86,90082,600
47,20044,900
87,40083,100
62,00058,900
92,30087,700
276,800263,000
339,000322,100
1,676,8001,593,000
51,40048,900
67,10063,800
130,400123,900
153,100145,500
최근등록   더보기 >
Western blot과 Real-time PCR에 결과 값이 다른것에 질문이 있습니다.   04.04
기기 차이   04.04
hemolysis activity의 positive strain이 궁금합니다.   04.04
미세조류(클로렐라) 배양 시 탄소원 문의   04.04
elisa   04.04
미생물 배양, 단백질 정제 화학지식?   04.04
hiv가 하루에 감염/제거하는 CD4+세포수, CD4+세포가 제거하는 hiv수   04.03
NI-NTA resin 공기 노출시 아예 사용못하나요?   04.03
.   04.03
Internal control이 exogenous로 따로 넣어줄 경우   04.03
이화여자대학교
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크