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SDM 목적에 따라 primer 길이는 달라집니다.
base 몇개를 대상으로 한다면 18mer, 20mer 정도면 충분하지만 base 10개 이상을
변화 시키려면 base 숫자 많큼 primer가 길어집니다.
따라서 반드시 primer 길이가 몇mer면 적당하다라고 말하기 힘듭니다.
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레벨1
lpg2314
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20.03.22 15:53
보통 아미노산 1개 (base 1~3개) mutation할 때, 저는 양쪽에 12~15 base씩 추가하여 최종 길이를 30mer 내외로 합니다. 5~6 base 정도의 가까운 위치에 동시에 mutation을 줄 경우, 한 primer pair로 디자인이 가능합니다. 마찬가지로 양쪽에 15base 정도 template와 complementary하게 디자인하구요. Forward, reverse는 완전 complementary하게 디자인하구요. Tm calculation했을 때 primer 기준 70C가 안 넘어가도록 하는게 중요합니다. 개인적으로는 60~65C 정도가 가장 좋은 것 같습니다.
만약, 서로 멀리 떨어진 여러 위치에 mutation을 넣을 경우, gibson assembly 방법을 이용해서 mutation이 들어간 primer pair를 서로 교차하여 PCR한 후, gibson 합니다.
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레벨2
bht4041
(대학원생)
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20.03.23 20:39
1bp를 바꾸는 경우에 주변 GC content가 높아 mutation 기준 양쪽 15mer로 짰을 때 Tm값이 70C 후반에 달하는 경우에는 어떻게 해야할까요?
우선 annealing temperature를 60, 70C로 둘 다 시도해 보았는데 transformation 결과 colony가 보이지 않았습니다.
PCR를 한 후에 gel loading 해보는 것이 좋을까요?