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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 정제한 primary antibody가 western blot에서 binding이 안되요
올챙이bsw6434(대학원생)  |  03.19 15:39

안녕하세요

단백질을 공부하는 대학원생입니다.

antibody를 만들기 위해, 먼저 제가 target으로 하는 미생물의 유전자 sequence를 획득하였고 cloning을 통해서 원하는 단백질을 과발현 시켰습니다. 이후 정제한 단백질을 mouse에 주사한 뒤 2차 부스팅까지 마치고, serum을 얻었습니다. 이에 대해서 단백질의 antibody가 잘 생성되었는지 확인하고자 western blot를 진행하였고, 확인결과 정제한 단백질과, 과발현 시킨 E.coli BL21의 단백질에는 band detection이 잘되었습니다.

*추가로 transfer에는 문제가 없었습니다.

하지만, antibody를 만든 후, 제가 원하는 target 미생물의 total cell에 정제된 antibody를 부착하여 western blot을 한 결과 band형성이 되지 않았습니다. primary antibody 비율은 1000:1로 진행하였습니다.

위의 western blot이 어떤문제점때문에 antibody가 안붙는지 알고싶습니다.

#antibody
 
#western blot
 
#protein
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.19 16:01  

1. 정제한 단백질과, 과발현 시킨 E.coli BL21의 단백질에는 band detection이

잘되었습니다.

: 이때 사용한 1st Ab는 어떤것을 사용했나요?

2. antibody를 만든 후, 제가 원하는 target 미생물의 total cell에 정제된 antibody

를 부착하여

: 앞에 있는 Ab는 mouse에서 정제한 target protein의 Ab라고 생각이 드는데

뒤에 있는 Ab는 어떤 Ab인가요?

3. 원래 항체를 직접 생산 할 때 가장 titer가 높은 시기를 확인 후 채혈하여

정제를 합니다.

현재 정제한 Ab와 Ab를 생산할 때 사용한 Ag를 사용하여 immuno-diffusion

test를 해서 침강선을 확인한 후 WBT에 사용하세요.

침강선이 안나오면 WBT에서도 결과가 안나옵니다.

 

 

올챙이bsw6434  |  03.19 16:36  

1. 정제한 단백질과, 과발현 시킨 E.coli BL21의 단백질에는 band detection이

잘되었습니다.

: 이때 사용한 1st Ab는 어떤것을 사용했나요?

> 쥐에게 주사하고 2차 부스팅까지 완료한 쥐에게서 뽑은 serum을 사용했습니다.

2. antibody를 만든 후, 제가 원하는 target 미생물의 total cell에 정제된 antibody

를 부착하여

: 앞에 있는 Ab는 mouse에서 정제한 target protein의 Ab라고 생각이 드는데

뒤에 있는 Ab는 어떤 Ab인가요?

> 동일한 Ab입니다.

 

대왕개구리SPEED  |  03.19 16:41  

1. antibody를 만든 후, 제가 원하는 target 미생물의 total cell에 정제된 antibody..

: 두 Ab가 동일한 Ab라고 했는데 동일Ab 사이에 binding하나요?

 

올챙이bsw6434  |  03.19 18:08  

1. antibody를 만든 후, 제가 원하는 target 미생물의 total cell에 정제된 antibody..

: 두 Ab가 동일한 Ab라고 했는데 동일Ab 사이에 binding하나요?

> primary antibody를 mouse에 주사하여 얻은 serum을 통해 antibody를 얻었고,

western blot을 진행할때, 하나의 membrane에 정제한 단백질, 벡터내 과발현시킨 유전자가 포함되어 있는 대장균, 그리고 다른 미생물에서의 유전자를 진행하였고, 세개의 단백질은 모두 동일한 단백질입니다. 

antibody역시 위의 언급한 단백질에 모두 detection되어야 하는 Ab입니다.

대왕개구리SPEED  |  03.19 18:26  

우선 Ab는 mouse에서 정제한 Ab를 사용하여 membrane에 정제한 단백질,

대장균에서 생산한 단백질, 다른 미생물의 단백질을 detection하는 실험인것

같습니다.

detection이 안된다고 했는데 질문에는 "단백질의 antibody가 잘 생성되었는지

확인하고자 western blot를 진행하였고, 확인결과 정제한 단백질과, 과발현

시킨 E.coli BL21의 단백질에는 band detection이 잘되었습니다." 라고 되어

있습니다.

그럼 mouse에서 생산한 Ab에 문제가 없다는 뜻인데 마지막 답변에 보면

detection이 안된다고 한것은 무슨 내용인지 이해가 안됩니다.

그리고 용어 또한 아래의 내용이 아닌가요?

- antibody를 만든 후, 제가 원하는 target 미생물의 total cell에 정제된

antibody를 부착하여

=> antibody를 만든 후, 제가 원하는 target 미생물의 total cell에 정제된

antigen(단백질)을 부착하여

결론적으로 mouse에서 생산한 Ab가 WBT에서 target 단백질과 결합을

하지 않는다면 immono-diffusin으로 확인하는 것이 가장 빠른 방법입니다.

 

 

 

 

1. antibody를 만든 후, 제가 원하는 target 미생물의 total cell에 정제된 antibody..

: 두 Ab가 동일한 Ab라고 했는데 동일Ab 사이에 binding하나요?

> primary antibody를 mouse에 주사하여 얻은 serum을 통해 antibody를 얻었고,

western blot을 진행할때, 하나의 membrane에 정제한 단백질, 벡터내 과발현시킨 유전자가 포함되어 있는 대장균, 그리고 다른 미생물에서의 유전자를 진행하였고, 세개의 단백질은 모두 동일한 단백질입니다. 

antibody역시 위의 언급한 단백질에 모두 detection되어야 하는 Ab입니다.

올챙이bsw6434  |  03.19 18:36  

detection이 안되는 부분은 다른미생물에게 동일한 Ab를 적용했을때만 되지 않습니다.

total cell의 전처리 과정은 균액을 키운다음 centri로 cell down후 sds를 섞어서 total cell을 준비하였고, 이를 그대로 loading하여 Ab를 붙였습니다.

 

개구리순똘  |  03.19 20:45  
특정 미생물의 유전자에 대한 항체를 만들어서, 미생물에서 발현되는 유전자를 확인하시려는 것 같습니다. 정제된 항체가 정제된 단백질은 검출하는것을 보면 항체 문제는 없습니다.

문제는 미생물에 있는것 같습니다. 그 배양조건에서 그 유전자가 발현이 잘된다는 것은 확인이 되었나요? 발현을 확인하기 위해 지금과 같은 실험을 진행중인것도 같은데, 현재 그 유전자 발현이 잘 안되고 있는것 같습니다.

유전자중에 발현레벨이 워낙 낮은 유전자들이나 특정 조건에서만 발현이 잘 되는 유전자들은 웨스턴으로도 검출하기 어려운 경우가 많습니다. 과발현 되도록 재조합 되었더라도 과발현이 정말 잘 되는지부터 확인 해보시고,
재조합된 미생물이 아니라면, 발현레벨을 최대화 시키기위한 배양 조건을 찾아보시거나, scale을 키워서 배양하시거나, 농축이나, 동결건조방법을 통해 단백질의 농도를 높여보시기 바랍니다.
개구리순똘  |  03.19 20:53  
혹은 발현된 단백질이 secretion되는것은 아닌지도 확인 해보시고,

정제된 단백질 과발현된 세포는 희석하셔서 로딩하시고 미생물의 로딩양은 최대로 해서 실험조건을 잡아보세요.(미생물에서 발현되는 단백질의 농도는 정제된 단백질이나 과발련된 세포에 비해서 농도가 낮을 확률이 높습니다. 로딩되는 타겟 단백질의 양을 최대한 비슷하게 조건을 잡아보세요.)
그리고나서 background 대비 타겟밴드가 잘 확인될 수있도록 조건을 잡아보세요. 정제된 항체의 농도는 모르겠지만 primary antibody 농도도 높여보세요. 항체 binding time이랑 film expose time도 길게 해보시구요. 항체의 specifity에따라 고농도의 항체가 필요한 경우도 많습니다. (물론 아까우시겟지만.., 원래 실험이 다 그렇습니다. 전 100:1로도 1차 항체를 많이 써봤습니다.)

뭐 western은 대부분 reduced 조건 및 sds가 있는 조건에서 하시겟지만 (일반적인 sds-page), non reduced 조건이나 native gel을 사용중이시라면,
배양조건에 따라 단백질 3차 구조와 s-s 결합 패턴이 다를 수 있고, 3차 구조와 s-s 패탄에 따라 동일한 단백질이더라도 항체가 인식을 못하기도 하니 참고하세요. (댓글을 보니 sds는 넣으셨던데, 넣을때 reducing agent(dtt나 bME)가 들어갔는지, 넣고 Boiling은 하셨는지 확인해보세요. 둘중에 하나라도 없으면 non reduced 조건일수 있습니다.)
개구리순똘  |  03.19 21:32  
정리.
1. western 조건이 native gel이거나 non reduced 조건이라면 reduced 조건의 sds page로 웨스턴 진행
2. 정제된 단백질과 과발현된 세포의 로딩양을 대폭 줄인뒤 (미생물에서의 타겟단백질과 양을 비슷하게 맞춘뒤) 웨스턴 조건잡기.
3. 2번으로 안되면 미생물 배양 scale을 키우든, 농축을 하든해서 미생물 lane에 더 많은 양의 타겟 단백질이 들어가게 한뒤 웨스턴

혹시 배양조건에서 발현이 잘 안되는건 아닌지, secretion되는 단백질은 아닌지 문헌조사는 병행
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