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질문 Primer sequence R 또는 Y일때 PCR
알치즈맛후추(대학원생)  |  03.19 15:28

현재 균을 이용해서 qPCR을 진행하고있습니다.

E.coli를 이용해서 standard curve는 잘 그려졌는데 Lactobacillus는 계속해서 실패하고있습니다.

논문에서 sequence를 찾아보니 염기서열에 R이나 Y가 하나씩 껴있는게 많더라구요 해당 서열이 어떤걸 의미하는지 아는데 그럼 해당 염기서열로는 Primer를 두개씩 주문하고 각 primer로 PCR을 따로 진행해야하는건가요?

아니면 한번 PCR돌릴때 R/F primer에서 해당 염기서열로 인해서 두개 주문한 Primer를 한번에 넣어야하나요? 

혹시나 위의 질문에 답변을 아시거나 Lactobacillus로 qPCR standard curve그려보신 분이 있으시면 답변 부탁드립니다. 

#qPCR
 
#Lactobacillus
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
앞다리CHINyo76_philekorea  |  03.19 17:56  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Lactobacillus로 qPCR을 진행해 본적은 없으나 primer에 degenerated base가 하나씩 존재한다면 굳이 따로 진행을 안하셔도 될 것 같습니다.

Lactobacillus의 경우 추출된 genomic DNA를 확인해 보셨는지 궁금합니다.

Gram positive bacteria로 알고 있는데 cell lysis가 제대로 진행되지 않으면 DNA 농도가 떨어질것으로 생각됩니다. 

확인을 위해서 추출된 Lactobacillus의 DNA 농도를 체크해보시는 것도 필요할 것으로 생각됩니다.

알치즈맛후추  |  03.19 21:09  

DNA농도는 확인해보았습니다 ㅠㅠ nano drop을 이용해서 체크했습니다

기존에 잘 그려진 E.coli에 비해 DNA농도가 훨씬 높았었는데 그 농도가 높아도 lysis가 잘 안될 수도 있는걸까요?? 

앞다리CHINyo76_philekorea  |  03.20 10:41  

DNA prep이 문제 없이 진행되었고, nanodrop 상에 concentration, purity 등이 문제가 없다면, qPCR 전에 routine PCR로 먼저 확인은 하셨는지요? 

annealing temp.에 대해 확인이 필요할 것으로 생각됩니다. 논문에서 온도조건과 차이나는 경우가 있을 수 있습니다. 

 

개구리순똘  |  03.20 18:35  
보유하고 계신 lacto 균이 언제 확보하신것인지 모르겠지만, 보유하고 있는 균의.서열이 ncbi와 다를수 있음을 고려하시고 필요한 부분의 서열을 확인해보시는게 좋을것 같습니다. (pcr후 시퀀싱. primer는 degenerative sequence가 없는 부분으로 design)
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