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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 wester blot detection
알털난찐빵(과기인)  |  03.19 13:35
첨부파일 파일첨부: PEDV M ORF3 N E.png (252 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요.

western blot을 한 후 detection을 하였는데 첨부된 사진처럼 maker가 membrane이 넘어간 것으로 보아 transfer할때 문제가 없었던 것같은데 원인이 무엇인지 잘 모르겠습니다.

 

*transfer이후

-blacking: 5% skim milk 1h

-TBST로 wash이후 1% skim milk 5ml에 1차 항체 1:1000비율로 넣고

RT에서 20min shaker로 섞어준 후 4도에서 overnight

-다음날 TBST로 10분씩 3번 wash, 1% skim milk 5ml에 2차 항체 1:5000

 비율로 넣고 RT에서 1h shaker에서 흔들어준 후 다시 TBST로 10분씩 3번

 wash 한 후 detection을 하였습니다.

#western blot
 
#membrane
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.19 13:49  

marker 어느 부분이 넘어 간건가요?

WBT 전체적으로 상태가 안좋습니다.

알털난찐빵  |  03.19 13:56  

아 넘어갔다는 표현은 gel에서 membrane으로 transfer 되었다는 얘기이구요. 

지금 저도 별도로 찾아보고 있긴 하지만 이유가 무엇인지 잘 모르겠어서 올린 것입니다.

대왕개구리SPEED  |  03.19 14:01  

transfer하면 gel에 있는 모든 단백질이 membrane으로 넘어갑니다.

알털난찐빵  |  03.19 14:14  

저.... 두번째 댓글은 좀 그렇네요.. 그건 당연한 거구요.. 마커가 transfer 되었다는 것은 단백질도 되었다는 거겠지요... 저는 그런 뜻으로 얘기한 것이구요.. 내가 설명한 부분이 부족한가면 제 잘못이겠지만... transfer하면 모든 단백질이 membrane으로 넘어가는 것을 모르고 물어보는 것일까요? 제가 묻고 싶은 것은 membrane이 왜 지저분하게 되었는지 알고 싶은 것이구요.. transfer쪽에 문제 인것같다는 말씀이시면 transfer쪽을 점검하면 되는데... 점검해 볼께요..

 

대왕개구리SPEED  |  03.19 14:17  

질문자의 질문을 보면 membrane이 지저분하다는 말은 한번도 안한것 같습니다.

transfer 문제만 얘기해서 답을 한 것이고 WBT 상태가 안좋다는 것은

첫번째 답에 적어 놓았습니다.

알털난찐빵  |  03.19 14:21  
네 적어 놓으신거 확인하였고 점검 해보겠습니다. 지저분하다는 것을 제가 빼먹었군요. 수정이 따로 안되네요. 그것외에 다른요인은 더 없는 것인지? 알 수 있을까요?
대왕개구리SPEED  |  03.19 14:29  

transfer는 문제가 없는거 같습니다.

그리고 전기영동에서 sample에 문제가 있습니다.

membrane에 발색이 많이 되는 것은 block이 잘안된 경우, 1차 항체의 양이 많은

경우, 2차 항체의 양이 많은 경우, 각 단계에서 washing이 잘안된 경우 등에

문제가 발생합니다.

어느 단계에서 문제가 발생했는지 하나씩 경우의 수를 줄여 보세요.

개구리Q.E.D.  |  03.19 14:29  
마커 상태를 보니 확실히 잘 넘어갔네요
다만 샘플들이 아닌게 문제인데
샘플을 보일링 한게 맞나요?
샘플을 로딩 할 때 보일링을 하고 오래되거나
보일링해도 농도가 높아 끈적거리면 저렇게
나오기도 합니다
웰 두께 기준으로 몇 ug을 로딩했는지
샘플 상태도 올려주시면 답변하는데 도움이 됩니다
알털난찐빵  |  03.19 14:49  

speed님 답변 감사하구요 하나씩 점검해볼께요. 혹시 다시 wash이후에 blacking하고 1차, 2차 항체 붙이는것을 진행해도 상관은 없겠죠?

 

보일링 및 쿨링을 했구요. 각각 10분씩 98도와 4도에서 진행했구요.

sample loading시에 끈적거리지는 않았습니다. 단백질 양은 따로 정한거 없이 sample buffer 5x짜리를 사용하여 sample 4: sample buffer 1 비율로 진행하였습니다. 지금 sample도 모양만 이상하지만 backgrand가 지저분한게 원인이 뭔지 모르겠어서  올린 것입니다.

개구리Q.E.D.  |  03.19 15:15  
나머지는 실험자 분 말씀처럼
speed님이 답변을 해주시는게 좋겠네요

참고로 쿨링 안 하는게 밴드가 더 잘 나오구요
핵 추출처럼 양이 극미량이라서
농도를 안 정하는게 아니라면 농도 재서 실험하세요

그럼 좋은 결과 내세요~
대왕개구리강시  |  03.19 18:39  
시료에 단백질 양 과다입니다.
우선 같은 양의 사료를 SDS-PAGE 를 걸고 염색해서 밴드가 깨끗하게 나오는지 확인하고 나서 WB을 하세요.
WB 결과 배드가 안나오고 저렇게 왕관모양으로 나오면 그 위치에 밴드를 만들기억는 너무 많은 단백이 있다는 의미입니다.
dd  |  03.19 22:46   

제 생각에도 1) 단백질 로딩양 과다 2) SDS 퀄리티 안 좋음 3) Tris 맛 갔음

세 가지 중 하나라고 생각합니다. 

일단 단백질 정량을 하시구요

50 ug 정도 걸어보세요. 

그런데 제 경험상 아무리 떡이 되게 걸어도 밴드가 저렇게는 안 나옵니다.

당장 내일 학교 가셔서 옆방에서 Tris와 SDS를 빌리셔서 transfer, running, sample buffer (즉 샘플도 다시 만드세요) 죄다 새로 만드셔서 다시 해보세요. 

아마 잘 될 겁니다.

그리고 background  지저분한 건 주로 transfer 이후 과정, 즉 blocking이 덜됐거나 washing이 덜 됐거나, primary 또는 secondary antibody 농도가 너무 높아서일 가능성이 큽니다. 대개 blocking이나 secondary 때문일 가능성이 크구요.

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