실험 Q&A Chemical biology > Analysis
HPLC Peak 문제에 대해 설명해주세요
레벨1 !!!!! (대학원생)
식물 추출물에서 gamma-aminobutyric acid(GABA)물질을 분석하고 있습니다.
여러 논문을 참고해서 GABA에 2-hydroxy-1-naphthaldehyde(HN)을 유도체화시켜서 HPLC로 분석하고 있습니다.
1. 유도체과정은
GABA STD 500ul+ 2-HN solution 500ul + 0.05M borate buffer (pH8.0) 300ul Mixutre를 80ºC로 10분간 Heating후 cool down 시킵니다.
GABA STD는 80% 메탄올, HN은 100% methanol에 용해시킵니다.
2. 분석조건
- C-18 reversed phase column(250X4.6mm)
- 이동상 : Methanol : water =66:34 로 isocratic elution
- flow rate : 0.8ml/min
- Detector : UV(230nm)
이사진은 작년 8월에서 GABA STD 유도체화를 분석한 Peak 결과이고 GABA retetion time은 6.7분쯤에 나옵니다. 초과된 HN은 15min에 나오구요.
그런데 현재 지금 다시 분석하기 위해 GABA standard를 유도체하여 찍은 결과 이렇게 나오고 있습니다. GABA의 retetion time도 앞으로 당겨져 4min에서 나오고 있고, Peak tailing도 심합니다.
컬럼의 문제라고 하기에는 다른이동상으로 다른 물질들을 분석할때 Peak의 문제는 발견되지 않습니다.
유도체화 과정의 문제라고 생각되어 buffer의 pH나 농도, heating 온도와 시간을 다 바꾸어보았지만 변화가 없없습니다.
Borate buffer의 문제일까요? 0.05M borate buffer (pH8.0)는 Boric Acid -Borax buffer로 만들고 있습니다.
1. 40mL distilled water
2. 0.07g of Borax
3. 0.11g of Boric acid
4. Adjust HCl solution to final pH 8.0
5. Until total volume is 50mL
이전에 유도체화가 잘되어서 나왔던 Peak가 왜 이번에는 안되는 걸까요? 어떤 조건에 변화를 주어야하는지 모르겠습니다.
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