실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
Western blot 잡밴드..거의 다 시도해본것 같아요ㅜㅜ
레벨1 오늘도다새거다 (대학원생)
안녕하세요
Western blot을 몇년째 하고 있는데 갑자기 원하는 밴드는 안뜨고 일정하게 다른 밴드가 뜨고 있습니다. 한 두달째...
다른 signal을 보는것도 아니고 his tag된 단백질을 정제해서 cell에 treat해서 보고 있는데 안나옵니다. 그래서 이전에 잘됐던 단백질로 해봐도 계속 똑같은 밴드들만 나오네요...
우선 실험 과정은
1. RIPA로 cell 모은 후 sonication 10s X 2
2. 센도리 후 상층액 정량
3. 120V SDS-PAGE
4. 250mA 1 h transfer
5. 5% 탈지분유 4ºC O/N
6. 1'Ab 1h R.T(원래는 1:1000)
7. 2'Ab 1h R.T(1:1만)
Washing은 TBST로 5min X 3 이상
바꿔본것으로는 우선 1'Ab를 세네개 정도 바꿔봤고, 2' Ab도 다른 실험실꺼 빌려보고, 1'Ab를 1:1만 까지 늘려서 4도씨 O/N해보고, blocking solution에 넣어서 O/N해보고, 버퍼들은 다 새로 만들어보고, Tween 20이 뚜껑이 안닫히는거라 다른 방에서 빌려도 보고, washing시간 횟수도 늘려보았습다. Cell의 문제일까 싶어 cell도 새로 깔아보았습니다. Sampling은 pro-prep으로 질소에 세번 넣었다 빼는것으로도 바꿔봤습니다.
Actin이나 정제한 단백질은 깨끗하게 잘 나옵니다.
희안한건 정제 단백질이나 control(아무것도 처리하지 않은 cell)을 sample과 같이 걸어서 확인하면 정제 단백질은 희미하게 나오고 control은 sample과 똑같이 나온다는 겁니다. 사진 첨부할게요.
제가 뭘 놓치고 있는지 모르겠어요
다른 시도해 볼만한게 있으면 알려주세요 ㅜㅜㅜ
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