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질문 Protein complex 관련 문의
알임콩(대학원생)  |  03.16 18:50

안녕하세요. 석사학위 준비중인 학생입니다.^^

저는 A와 B라는 단백질을 배양 및 정제하여 두개의 complex를 확인하려고 합니다.

가장 기본적인 방법으로 native gel 을 내려보았으나 문제는 두 단백질의 pI값입니다.

A는 5.3정도이고 B는 9.27정도입니다.

이런경우 일반적인 native gel로는 확인이 어려울것 같은데 이처럼 positive negative charge protein을 동시에 거는 방법이 있을까요?

native가 어렵다면 in vitro binding assay 의 방법을 하나 선택하면 될까요?

참고적으로 두 단백질 모두 His tag가 달려있고 B는 A의 수용체로 알려져있습니다.

#Protein
 
#complex
 
#interaction
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.16 19:32  

1. 각 단백질의 분자량이 어떻게 되나요?

2. 그리고 두 단백질의 binding 힘이 강하나요?

3. 결합된 단백질이 떨어지는 조건이 있나요?

대왕개구리강시  |  03.16 19:52  

두 단백질이 결합해서 어떤 (기능적) 구조를 이루는 것이라면 GST pull down도 좋은 방법입니다.

한 유전자의 N-terminal  또는 C-terminal에 GST 유전자를 fusion 시켜서 발현시키고 정제한 후 다음 단백질을 발현시켜서 결합시킨 후 GSH affinity 컬럼으로 정제하면 GST-protein A-protein B 가 한번에 정제되어 나옵니다.

 

결합해서 안정된 구조를 이루는 것이 아니라면 yeast two hybrid를 이용하는 것도 좋습니다. 

알임콩  |  03.16 20:49  

우선 두분의 답변에 감사합니다.

 

스피드님께서 주신 질문에 답은 두 단백질의 크기는 각각 약 13kDa, 25kDa이며 binding 힘은 그리 강하지 않습니다 ㅠ

다만 떨어지는 조건에 대해서는 제가 정확히 아는 바가 없습니다..

 

강시님께서 추천해주신 방법도 시도해보겠습니다.

대왕개구리SPEED  |  03.17 10:37  

두 단백질이 정제된 상태가 아닌가요?

정제된 상태라는 전제하에 GPC, 비변성 SDS-PAGE에서 확인을 한번 해보세요.

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