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레벨1
biochobo
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20.03.15 15:45
실험에 실패하고 실험을 재진행하기 앞서 자신의 실험에서 어느 부분이 잘못되었는지 확인하는 trouble shooting을 통해 문제를 확인하고 진행해야합니다. 그냥 어디가 잘못되었는지 모른채로 다시해보고 다시해보고하는것은 늘 같은 실수의 반복만 있을 뿐이죠..지금 질문해주신 걸 보면 자신이 transfection때문 인 것 같다는 생각은 하고있으신데 주시는 정보는 뭔가 부족하네요ㅜㅜ
일단, WB 할 때 BCA 등으로 정량하시나요??
housekeeping이 적게 나왔다면 protein 양을 더 늘려서 찍어보시는게 어떨지..
Transfection으로 무엇을 한 것인지는 모르나 저희 실험실은 transfection으로 sh KD하고 WB으로 확인하는데 WT에서도 protein이 너무 적게 발현되는 경우에는 protein을 30 ug이상까지도 걸어서 측정해본적도 있고요.
아니면 Develop하는 ECL이 오래된건 아닌지.. 너무 protein이 적게 모을수 밖에 없는 상황이라면 ECL보다 감도가 높은 thermo사의 Femto reagent를 추천드려요. thermo사가 아니더라도 국내 기업의 고감도 시약을 사용해보시는것도 괜찮을 것 같구요.
transfection이 의심되신다면 어느 부분에서 실수가 있는지 한번 실험과정 하나하나를 잘 기록하고 실험실 분들께 여쭈어보는것도 좋을 것 같습니다.
일반적으로 저희실험실은 transfection하기 전에 low serum media로 세포를 굶겨놓고 들어가는 antibiotics들은 모조리 뺀 상태로 seeding했습니다. 그후에 plastic ware와 접촉이 많을 수록 transfection수율이 확떨어진다고해서요. pipetting도 최소화하고 절대 reagent를 voltex하지도 않고 사용합니다.
이외에도 잘못될 가능성이 있는 부분은 여러가지라서..자신이 했던 방법을 최대한 올려주시면 다른분들이 도움을 드리기 쉬울것같네요..
도움이 되셨으면 좋겠습니다. 안녕히..
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레벨5
분자생물학이란
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20.03.15 22:28
Transfection 여부는 확인하신건가요?
질문으로 봐서는 Transfection 문제 인 것 같은데요.
293T와 같은 Transfection이 잘되는 세포에서 먼저 테스트해보세요.
본인이 사용하는 Transfection reagent가 잘 작동하는지, 그리고 Transfection 하는 DNA가 잘 작동하는지..
293T같은 세포에 확인했는데도 안된다면, Transfection reagent 또는 DNA 문제이기 때문에 여기서부터 해결하셔야합니다.
문제 없이 잘된다면, 실제 사용할 세포에서 Transfection 조건을 다시 잡으셔야 합니다.
세포마다 Transfection 조건은 매우 다릅니다.
Transfection reagent가 왜 이렇게 다양하게 많은지를 생각해보시면 답이 나옵니다.
굿럭.