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F/R primer 모두 72도 부근인가요?
2 step으로 PCR하는 경우도 있습니다.
primer가 몇mer인가요?
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레벨2
bht4041
(대학원생)
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20.03.11 15:29
Site directed mutation용이라 primer는 둘다 29mer로 mutation이 중앙에 1bp 들어가게 했고 둘다 GC content가 83%입니다.
NEB에서 Q5용 primer anealing temperature calculator에 넣었을 때 72도가 나오고 제가 쓰는 oligocalculator에서는 75도로 나옵니다.
Site directed mutation용이라고 해도 29mer면 그리 긴 primer도 아닙니다.
GC가 83%면 상당히 높아서 annealing temp.가 올라간것 같습니다.
Taq 종류는 Pfu를 사용해야 할것 같은데 PCR이 잘 될지 모르겠네요.
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레벨2
bht4041
(대학원생)
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20.03.11 15:51
Q5 polymerase도 blunt end 만드는 걸로 알고 있어서 이거 이용해도 괜찮겠죠?
만약에 anealing, extension 둘 다 72도로 한다할 때, one-step, two-step으로 진행하는 시간 조언해주실 수 있나요? one-step으로 하는 경우는 처음이라고 궁금합니다.
blunt end를 만드는 증폭 효소는 성질이 대부분 비슷합니다.
error률일 낮은 바면 일반 Taq보다는 조금 증폭조건, 효율이 까다롭습니다.
one step은 없구요 2 step은 말그대로 93도, 72~68도만으로 증폭하면 됩니다.
이런 경우 일반적인 Site directed mutation 보다는 mutation target gene만 가지고
PCR mutation하는 것도 좋을 듯 합니다.
이경우에는 F1/R1, F2/R2 primer가 필요합니다.
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레벨2
bht4041
(대학원생)
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20.03.11 21:20
굉장히 감사합니다 형님