실험 Q&A Immunology > Antibody
western blot 으로 beta actin을 찍었는데 밴드모양이 이상하네요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
레벨1 버섯님 (대학생)
c57 mouse의 갈색지방 조직에서 bradford방법으로 정량화하여 단백질을 추출해서 western blot을 실시했습니다. beta actin은 모든 밴드가 일정하게 나와야하는데 어떤건 엄청 진하게 끌려서 나오고 어떤거 연하게 나오고 밴드모양도 구불구불하게 나오는데 뭐가 문제 인건지 모르겠습니다......ㅠㅠㅠㅠ
실험은 대략 아래방법으로 실시했습니다.
1. sample을 넣지 않은 겔을 20분 동안 80v로 pre-run을 실시한다.
2. 겔에 30μl의 sample을 각각 분주하고 상단 겔까지는 50v로 loding하고 하단겔부터는 95v로 loding한다.
3. loding이 완료되면 semi transfer기기를 이용해 25v, 1.0A로 30분동안 transfer를 실시한다.
4. transfer가 완료되면 멤브레인을 메탄올에 잠간 담궜다 ponseau 염색을 실시한 후 증류수로 적당히 헹구어 준후 TBST buffer로 5분씩 3회 헹구어 준다.
5. 3% BSA용액을 이용해 상온에서 2시간동안 blocking을 실시한다.
6. blockong이 끝나면 3% BSA, 0.02% sodium azide가 포함된 TBST buffer에 1차 항체를 1000:1로 희석해 멤브레인에 분주한 후 4도씨에서 overnight시켜준다.
7. overnight 으로 1차 항체를 붙인 멤브레인을 5분씩 3회 TBST로 washing 해준다.
8. 3% BSA가 포함된 TBST buffer에 1차항체에 맞는 2차 항체를 1:20000로 희석해준다
9. 멤브레인에 2차항체를 1시간 반 동안 incubation시켜준다.
10. 2차항체를 붙인 멤브레인을 TBST로 10분씩 3회 washing 해준다.
11. washing 끝난 멤브레인에 ECL solution을 이용해 잠시 incubation을 시켜 준 후 detection한다.
Bio마켓 프리미엄