같은 실험자로 고민해봅니다.
treatment 후 셀이 없어진다면.. 죽은거겠죠.. toxicity 때문이라든지.. adhesive 한성질이 준다든지.. treatment 첵업 부탁드리고요
보통 96 well 을 쓸땐 바깥부분은 안쓰고 중간 웰들만 쓰는데.. 참고하시고요 24웰은 바깥 다빼면.. 뭐 12 웰만 남는식이라서.. 저도 잘 모르겠네요..
MTT 를 24웰에 쓰는건... 이유가 있으시나요 ?첨 보는 MTT 프로토콜이네요.
그래도.. 뭔가 잡혀가시나봐요 조금만 더 힘내세요
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레벨1
혐기성박테리아
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20.03.05 11:09
위에 분이 말씀하신대로 treat 뒤에 세포가 떠있는 경우(treat전에는 멀쩡)
sample에 의한 독성 때문입니다. Control 군은 treat 이전과 동일 하겠죠?
그리고 가끔 트리트하실때 (어떤방식인지는 모르겠지만) well 벽이 아닌 well바닥에 직접적으로 쏘는경우
물리적인힘에 의해 세포다 떨어져 나가는경우도 발생합니다.
사진상 control은 멀정한것으로 봐서 샘플의 독성때문으로 보이며 샘플의 농도를 낮춰 진행하면 되실것같습니다.
위에 분이 말씀하신 96well겉에 부분 안쓰는건 과거에 spectrophotometer기가 좋지않아 겉에와 안쪽 흡광도가 다르게
측정되는것 떄문에 안쓰는 것이였는데 최근 기기들은 이런것을 다 보정되어나와 겉에 사용해도 무관합니다.
저도 MTT때 96well이 아닌 24well 48well을 사용하는데 개인적인 이유로는 96well이 적은 세포수와 한번에 다량읜 sample을 보는데 용이하긴하나
그세포량이 너무적어 베리에이션이 심하거나 석션시 세포다 같이 빨려오는 경우가 발생하여 좀더 넓은 24well 48well에 진행하여
이런 변수를 제거하기 위해 썼던 경험이있었습니다.
저의 경험에 기반한 개인적인 의견이니 참고만 하여주세요.
저는 독성에 의해죽은 것은 아니라고 생각합니다.
현미경상으로 세포가 붙어있는것이 플레이트에 단단하게 부착된 것을 의미하지 않습니다.
즉, 미디어를 바꿔준다 던지 무언가를 treat하는 등 물리적인 충격을 가해줄 때 얼마든지 세포가 떨어질 수 있습니다.
세포마다 well 또는 dish 등에 붙어있는 강도는 모두 다르며,
심지어 그 dish 등의 크기에도 많은 영향을 받습니다. (growth area)
제 경험상 이러한 충격으로 세포가 떨어지는 것은 2번 이상의 석션과정에서 발생합니다. (첫번째 관찰에서는 잘 붙어있으나 후에 떨어짐)
제가 추천하는 확인방법은 아래와 같습니다.
먼저 세포가 물리적 충격에 의해 떨어지는 것인지 확인한 뒤
만약, 그것이 맞다면
1. seeding후 안정화 시간을 늘려준다. (24h정도)
2. treatment 시 배지 전체를 갈아주기보다 adding의 형식을 채택한다.
같은 실험하는 실험자로서.. 제 실패 경험 바탕으로 답변 드립니다 ㅎㅎ
mtt assay 중 seeding된 cell이 떨어지는 경우는, 물리적인 충격으로 cell이 떨어지는 경우도 있구요 (treat 시 well벽으로 분주)
다음으로는 온도인데요,
37도씨에 맞춰지지 않은(저온의) media를 사용했을 경우 incubator안에서 급격히 외부 온도가 상승하여
비교적 따뜻한 쪽으로 자라기 위해 cell들이 well벽으로 이동하여 자라는 문제가 생길수도 있습니다.
sample treat시 well에 바로 분주하시나요? 저는 media에 미리 희석해서 media와 함께 voltex후 분주하니 가운데만 비거나 하는 일은 적어졌습니다
그리구 저는 cell있는 media를 voltex해서 쓰기도 했는데요.. 그거는 세포 독성에 그렇게 영향이 크진 않더라구요
작성한 답변이 어느정도 도움이 되셨으면 좋겠네요.. 우리 힘내요 ㅎㅎ