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 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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질문 mammalian cell prep 도움 받고싶습니다!
알cunDO(대학원생)  |  03.03 20:59

안녕하세요! 아직 부족한 부분이 많은 대학원 1학년 학생 입니다.

mammalina cell에서 chromosomal을 prep하는 실험을 하고 있는데, pellet이 잘 안풀리고, 농도가 낮게 나와서 도움을 받고자 이렇게 게시물을 올렸습니다.

제가 진행한 실험 과정은 

1. cell 준비

2. cell down & 1xPBS로 wash 

3. lysis buffer (RIPA buffer) 로 cell pellet을 풀어준 후, 50℃ o/n

4. phenol down (+RNase A)

5. ethanol down (100% -> 70%)

- 100% ethanol + 3M sodium acetate (10x) 추가 해준 후, -70℃ 2hr -> down -> 70%

6. resuspension pellet in TE

이 과정으로 진행하였습니다. ethanol down 후 pellet을 resuspension 해줄 때 잘 안녹습니다 ㅠㅠ

충분히 말려 준 후 resuspension을 진행 하였고, TE buffer를 넣어 준 후 50℃에서도 녹여봤는데 잘 안녹아요,,, 당연히 농도도 낮게 나오구요,, 혹시 제가 진행한 protocol에 문제가 있을까요? 이유를 아시는 분 계시면 도움 받고 싶습니다 ㅜㅜ

#mammalian cell prep
 
#chromosomal prep
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.03 21:54  

2번 washing 후 원심분리는 얼마나 했나요?

3번 o/n은 보지못한 방법이고 30분~1시간이면 충분합니다.

RNase는 3번에 넣으세요.

4번 phenol은 PCI를 사용했나요?

 

알cunDO  |  03.04 10:16  

안녕하세요 SPEED님! 답변해주셔서 감사합니다! 

 

2번 washing 진행 했을 때 500xg 5min으로 진행 했습니다. 

3번 o/n 한 것은 아래 protocol을 참고해서 진행했고, Phenol은 PCI 사용했습니다!

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124186873000136

Lysis buffer에 Proteinase 만 넣고 RNase A는 Phenol step에서 넣었네요 ㅠㅠ 다음번에 다시 진행 할 때, Lysis buffer 단계에서 넣도록 하겠습니다.

cell 양은 1x 10^6 cells로 진행했는데 혹시 cell 수도 크게 영향이 있을까요?

대왕개구리SPEED  |  03.04 11:32  

- 2번 washing 진행 했을 때 500xg 5min으로 진행 했습니다. 

: 최대한 낮은 속도로 원심분리하는것이 좋습니다.

- Lysis buffer에 Proteinase 만 넣고 RNase A는 Phenol step에서 넣었네요

: PCI 단계에서 어떤 효소를 넣든지 모두 변성됩니다.

- cell 양은 1x 10^6 cells로 진행했는데 혹시 cell 수도 크게 영향이 있을까요?

: 1 x 10^6 cell이 tube당 사용한 cell수이면 조금 적은것 같습니다.

당연히 cell수에 따라 추출된 gDNA양이 달라지고 너무 많은 cell을 사용하는

것은 오히려 좋지 않습니다.

알cunDO  |  03.04 14:12  

SPEED님 추가 답변내용 감사합니다!

답변해 주신것 토대로 수정해서 다시 실험을 진행해보겠습니다 :-) 

혹시 말씀해주신것 이외에도 혹시 chromosomal prep시 문제가 될 부분이 있을까요?

Pellet이 잘 안풀리는 이유는 뭘까요 ㅠㅠㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  03.04 14:26  

pellet은 PBS에서 풀때하고 lysis buffer에서 풀때하고 현상이 조금 다릅니다.

pipette으로 아주 천천히 up and down하면 최대한 풀어집니다.

RIPA를 얼마나 넣나요?

처음에 cell pellet을 잘 풀지 않으면 lysis 중에도 뭉쳐져있고 이후 PCI를 넣으면

cell 뭉친것의 표면이 1차 변성되어 gDNA 추출 수율이 낮아집니다.

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