실험 Q&A Cell Biology > Cell Culture
3T3-L1 Oil Red O staining
레벨1 해답자 (대학생)
안녕하세요 선배님들.
Speed님을 비롯한 여러 선배분들의 도움으로 3T3-L1에 대해 보다 더 이해하게된 후학입니다.
오늘은
1. 선배님들께서는 3T3-L1의 maintanence에 중요한 Bovine Calfe serum을 사용하실 때, Filtering을 해주고 사용해야 하시는지 궁금합니다.
저는 주문한 Bovine Calf serum을 heat inactivation시킨 다음, 바로 분주해서 사용해왔는데, 이때문에 제가 키우는 Cell이 분화화시키고 나서 Contamination되는 것이 아닌가 의심이 되어 질문드렸습니다.
2. passage 4인 3T3-L1 Stock을 풀어서 Cell을 Culture하려 했는데, 하루가 지난 뒤 보닌까 Cell이 거의 붙지 않고 떠있었습니다. 그래도 붙어있는 Cell이 아주 조금이나마 있길래 키우고있습니다.
다만, 이렇게 Low density로부터 proliferation시키는 것은 처음이고, Cell 상태에 이상은 없는지 잘 구분이 되지 않아 이 Cell을 키워서 분화시켜도 분화가 잘 될지 미지수입니다. 선배님들의 생각은 어떠신가요?
3. 선배님들의 조언에 힘입어, 어렵게 분화가 잘된 Cell plate를 건져서 Oil Red O staining을 실시했습니다.
제 프로토콜은
1) media suction
2) pbs washing
3) 4%PFA 처리
4) pbs washing
5) 70% isopropanol 처리
6) Oil Red O solution 처리 후 O/N
7) D.W로 3회 washing
입니다.
이렇게 한 후, 현미경 관찰을 해보면, 분명 lipid droplet이 있는데 염색이 되어있질 않는 부분이 많습니다.
대체 뭐가 문제인지 잘 모르겠습니다. 제가 생각한 Trouble shooting으로는 1) Oil Red O solution이 오래되었다.
2) Alcohol은 lipid를 제거하는 기능을 가지기에, 70% Isopropanol이 원인일 수도 있다.
이정도 입니다. 선배님들....제가 놓치고 있는 부분을 알려주시면 정말 감사하겠습니다.
4. 3번 질문에 연관지어서, Oil Red O staining에도 불구하고 lipid가 염색되지 않았다고 가정해보겠습니다. 이 상황에서 Oil Red O solution을 다시 Well에 처리했을때, 염색이 될지 궁금합니다.
항상 도움만 갈구하여 죄송한 마음도 크지만, 그만큼 선배님들의 조언이 큰 힘이 됩니다. 항상 감사드립니다.
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