실험 Q&A Microbiology > Bacteria
sds-page시 샘플이 제대로 내려가지 않습니다.
레벨1 돼지go기 (대학원생)
샘플 2가지를 LC/MSMS 분석을 위해 1D sds page를 내리는데 위 사진처럼 stacking gel에 잘려진 단백질이 걸려보이기도 하고 loading gel에는 밴드 걸리지 않고 끌리듯이 내려갑니다. 마커사이의 끌리듯 보이는 것이 샘플입니다. 중간 빈부분과 마커를 제외한 부분은 dw 로딩입니다.
stacking gel에서 못내려오는 것 같기도 하고 첫번째 250사이즈 마커 라인에서 한번 더 진하게 끌리는 것처럼 보이기도 합니다.
초반내려갈때는 well에 무언가 걸린듯한 모습이 보이고 끌리는 형태가 많이 보이는데 마지막즈음에는 well에 걸린듯한 것과 끌리는 듯한 모습이 거의 안보입니다. 하지만 염색을 하면 이렇게 끌린 모습이 보이네요. 뭐가문제인지 잘 모르겠습니다.
두 샘플은 E.coli에서 분비되는 20-400nm 사이즈의 outer membrane vesicles입니다.
E.coli를 TSA에 키운후 cell down 후 0.45um filter 이후 100kDa hollow fiber column을 통해 농 -> 45500rpm 3h으로 pelleting하고 Tris-HCl(ph8)에 녹임. 혹시나 tsa가 문제일까봐 tris 대략 25ml에 펠렛을 녹인후 다시 45500rpm 3h으로 re-pelleting하고 tris 220ul에 녹였습니다.
BCA protein assay으로 단백질 정량하였고 두 sample 모두 2.7ug/ul로 맞추었습니다.
sample 20ul + 5x sample buffer 5ul 로 총 25ul 로딩 하였습니다.
5x sample buffer 넣고 vortex-spin down 후 RT 30min 정치 후 30min 끓인 후 ice 15min 정치하고 로딩하였습니다.
로딩하려고 피펫으로 25ul 뽑을때도 약간 점성이 느껴지고, 사진의 오른쪽 dw로 만든 샘플과 비교시 tube 벽면에도 흔적이 있습니다.
Bio-rad에서 판매하는 mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels 10% 사용,
SDS loading buffer 4 gel 선까지 가득 채웠습니다.
stacking gel - 80V, loading gel - 130V
coomassie blue 30분 염색후 distaining 하였습니다.
Bio마켓 프리미엄