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질문 sds-page시 샘플이 제대로 내려가지 않습니다.
알돼지go기(대학원생)  |  02.28 21:31

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샘플 2가지를 LC/MSMS 분석을 위해 1D sds page를 내리는데 위 사진처럼 stacking gel에 잘려진 단백질이 걸려보이기도 하고 loading gel에는 밴드 걸리지 않고 끌리듯이 내려갑니다.  마커사이의 끌리듯 보이는 것이 샘플입니다. 중간 빈부분과 마커를 제외한 부분은 dw 로딩입니다.

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stacking gel에서 못내려오는 것 같기도 하고 첫번째 250사이즈 마커 라인에서 한번 더 진하게 끌리는 것처럼 보이기도 합니다.

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초반내려갈때는 well에 무언가 걸린듯한 모습이 보이고 끌리는 형태가 많이 보이는데 마지막즈음에는 well에 걸린듯한 것과 끌리는 듯한 모습이 거의 안보입니다. 하지만 염색을 하면 이렇게 끌린 모습이 보이네요. 뭐가문제인지 잘 모르겠습니다. 

 

두 샘플은 E.coli에서 분비되는 20-400nm  사이즈의 outer membrane vesicles입니다.  

E.coli를 TSA에 키운후 cell down 후 0.45um filter 이후 100kDa hollow fiber column을 통해 농 -> 45500rpm 3h으로 pelleting하고 Tris-HCl(ph8)에 녹임. 혹시나 tsa가 문제일까봐 tris 대략 25ml에 펠렛을 녹인후 다시 45500rpm 3h으로 re-pelleting하고 tris 220ul에 녹였습니다. 

BCA protein assay으로 단백질 정량하였고 두 sample 모두 2.7ug/ul로 맞추었습니다. 

sample 20ul + 5x sample buffer 5ul 로 총 25ul 로딩 하였습니다. 

5x sample buffer 넣고 vortex-spin down 후 RT 30min 정치 후 30min 끓인 후 ice 15min 정치하고 로딩하였습니다. 

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로딩하려고 피펫으로 25ul 뽑을때도 약간 점성이 느껴지고, 사진의 오른쪽 dw로 만든 샘플과 비교시 tube 벽면에도 흔적이 있습니다.

Bio-rad에서 판매하는 mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels 10% 사용,

SDS loading buffer 4 gel 선까지 가득 채웠습니다.

stacking gel - 80V,  loading gel - 130V 

coomassie blue 30분 염색후 distaining 하였습니다. 

 

 

 

 

#sds-page
 
#protein
 
#vesicle
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  02.28 21:57  

heating은 충분히 했나요?

outer membrane vesicles 자체는 전기영동이 안됩니다.

well에 상당히 불용성 물질이 남아있습니다.

outer membrane vesicles을 분해해서 포함된 단백질 이라면 전기영동이 됩니다.

올챙이tjioo;  |  02.28 23:28  

지질층을 없애고 단백질만 분리해내는 방법을 찾아서 적용해보는 것이 어떨까요.  가끔 저런형태를 보이면 전 그냥 loading dye를 더 넣고 heating을 100C에서 10분 해서 내리면 좀 나아지기도 했습니다. 30분씩이나 끓여버리면 단백질 다 깨져서 더 smearing하게 됩니다. 

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