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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 웨스턴 샘플 로딩 시 팁을 얻고 싶습니다.
개구리n_jyoung92@naver.com(대학원생)  |  02.27 19:16
웨스턴 샘플 로딩을 하는데요. 1.5 두께 15개 lane을 이용하고 있고 25ul를 로딩합니다. 로딩할 수 있는 맥시멈 볼륨이 25ul로 나와있기도 하고 넘치는 것 같지 않아서 유지하고 있습니다. 그런데 천천히 피펫팅을 하고 마지막에 피펫을 한번 더 누르는 과정에서 샘플 로쓰가 일어나는 것 같습니다. 마지막에 한번 더 누르는 과정을 하지 않았을 때가 오히려 웰에 더 담겨(?)있는 느낌입니다.로딩하는 양을 줄이는 게 당연한 해결책이겠지만 가지고 있는 샘플의 단백질량과 원하는 단백질량 등을 계산하여 여의치가 않습니다..

그리고 로딩팁(?)이 따로 존재하는 지 잘 모르지만 저희는 없기에 일반 팁을 사용하면 로딩하려고 버퍼에 진입할 때 피펫을 누르지 않았음에도 조금이지만 샘플이 버퍼에 녹아들더라구요.

동량의 단백질을 로딩해야 하는게 가장 중요한데 육안으로 봐도 로딩이 들쭉날쭉된 것이 보여서 조언을 통해 스킬을 얻고 싶습니다.
#웨스턴
 
#샘플
 
#로딩
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  02.27 19:59  

well volume이 25ul면 25ul를 loading하기에는 할때마다 동일양을 loading하기

힘듭니다.

현재 상황은 당연한 결과이고 skill이 부족한것은 아닙니다.

15well gel을 사용하는 이유가 있겠지만 정확한 결과가 중요하기 때문에

loading하고 20% 정도 공간이 남도록하는 것이 가장 좋습니다.

시료 농축을 하든지 아니면 10well gel을 사용하는 것을 추천합니다.

loading하기에 편한 pipette tip도 있지만 별로 사용해본 경험은 없고 일반 tip을

사용하지만 loading skill이 부족한 연구자는 사용해보는것도 좋을 듯합니다.

그리고 일반 tip은 sample buffer에 glycerol이 들어 있기 때문에 well에 넣으면

간혹 sample이 바로 아래로 빠져나가는 경우도 있습니다.

하지만 현재 전기영동에 사용하는 micropipette의 O-ring을 한번 점검해보세요.

진공에 약간 문제가 있는 느낌도 듭니다.

 

개구리n_jyoung92@naver.com  |  02.27 22:30  

답변 정말 감사합니다!!

한가지 여쭤보고 싶은게 있는데요. 전기영동을 하는 데 gel을 3개만 만들어서 탱크안에 2개의 gel을 꽂은 프레임+ 한개의 gel과 빈 유리를 꽂은 프레임을 꽂았습니다. 빈 유리를 꽂은 건 버퍼를 채우기 위함이었는데요.

전압을 걸어보니 한 개의 gel과 두 개의 gel이 내려오는 속도가 달랐습니다. 한 개의 gel(빈 유리가 꽂힌 쪽)의 경우 더 빠른 속도로 내려왔으며, 샘플들이 퍼지면서(?) 내려오는 듯한 느낌을 받았거든요. 여태까지 하던 것과는 달랐습니다. 

한 개의 gel만 꽂았을 뿐 원래 하던 대로 진행을 했는데 왜 다른지 궁금합니다.

무조건 전기영동을 할 때에는 한 프레임에 양쪽 두개의 gel을 걸어야 하나요?? 

대왕개구리SPEED  |  02.27 23:11  

DNA 전기영동(수평)과 달리 단백질 전기영동(수직)은 공급하는 전압, 전류가

gel에 미치는 영향이 다릅니다.

DNA 전기영동은 전기영동 tank buffer에 전류, 전압이 균등하게 흐릅니다.

따라서 gel을 통과하는 전류, 전압이 gel tray 크기, gel tary 수에 약하게 영향을

줍니다.

그러나 단백질 전기영동은 upper tank(- charge)에 걸리 전류, 전압이 100% gel을

통해서 lower tank(+ charge)로 전달되기 때문에 gel 수에 따라 band 이동 속도에

많이 차이가 있습니다.

2 gel 대비 1 gel의 경우 전압, 전류를 줄여서 전기영동 하면 비슷한 속도 및

저항이 감소해서 band도 sharp하게 내려갑니다.

단백질 전기영동 장치가 대부분 수직으로 되어있는 원인 또한 이 질문과

관련이 있는데 이것에 관련해서 추가 질문이 있으면 메일로 연락 주시기

바랍니다.

speedk89@naver.com

n_jyoung92@Naver.com  |  02.28 17:54   

친절한 답변 정말 감사합니다!!!

세 가지 정도 여쭤보고 싶은데 도움 주시며 감사하겟습니다ㅠㅠ

1. 트랜스퍼를 오래해도 단백질이 멤브레인을 절대(?) 빠져나가지 않나요?

2. 정해진 시간의 트랜스퍼가 끝나고 탱크안에서 한동안 놔둬도 괜찮나요? 

3. 모든 lane을 가급적이면 채워서 전기영동을 내려야 곧게 내려오는 걸로 알고 있는데요. 혹시나 해서 1, 14번 lane에 marker, 2~13번은 샘플을 걸고 15번은 아무것도 걸지 않고 내려보았더니 14번이 15번쪽으로 살짝 밀리더라구요. 14번에 marker을 넣어줌으로써 벽(?)을 세운다는 느낌으로 진행하였던 건데 이렇게 해도 밀리는 건가요?

dd  |  03.02 17:54   

저도 15well에 최대 volume을 loading 하고 있는데요,

저는 loading하고 tip 끝에 남은 양은 well loading한 위치보다 약간 좀더 위의 위치에서 pipette을 눌러주면 well의 sample이 건들리지 않고 tip안에 있던 양이 well로 딱 떨어지더라고요!

말로만 설명하는게 잘 전달이 안될것 같긴하네요...ㅎㅎ

저는 위의 방법으로 한 이후로는 well이 넘치진 않았어요!

 

최대 volume 어려우시면 loading 전용 tip을 사용하시는 것도 하나의 방법이 될수 있을것 같아요~

개구리DTer  |  03.02 19:11  

1. 샘플 로딩은 다양한 방법으로 해결이 가능합니다.

->편법이긴 하지만, 현재 상태로 가능한 방법은 70-80% 로딩 후 높은 전압으로 잠깐 흘려 샘플이 어느 정도 내러 가면, 나머지를 마저 로딩하여 진행하는 방법이 있습니다. 이렇게 해도 결과에는 별 차이가 없습니다.

이러한 조건의 실험을 계속 해야 한다면,

1) 샘플 조제 시 사용하는 buffer를 적게 (적정 범위 내에서) 사용하여 농축된 샘플을 만들어 로딩량을 줄이는 방법

2) 큰 comb을 사용할 수 있도록 보다 넓은 전기영동 시스템으로 바꾸는 방법

 

2. 전기영동 시 사용하는 gel 수에 따른 속도 차이

1) Constant setting을 사용한다면, 전류(A)대신 전압(V)으로 해 보기

->Gel 1장과 2장의 차이는 전류가 흐르는 통로 즉, 차선으로 치면 1차선과 2차선의 차이로, 1장이 전류량이 적은데 전류로 고정하면 전압이 올라가 속도가 빨라지게 됩니다.

 

3. 빈 lane 채우기

남는 lane을 그대로 두면 한쪽으로 쏠려 전기영동 결과가 좋지 않게 됩니다.

1) 남는 lane은 샘플과 같은 조성의 loading buffer를 동일량으로 채운다.

2) Marker의 경우 사용량이 적은데 이때도 volume을 늘려 샘플과 동일량으로 로딩한다.

3) 샘플도 당연히 동일량으로 로딩한다.

 

tilldawn  |  03.03 18:24   

다른 여러 방법도 있긴 한데요..

 

제가 했던건

 

sample 녹이는 버퍼 (5X 쓰시나요?) 의 glycerol 농도를 살짝 올려줘서 해결 했답니다.

 

로딩하면 차분히 가라앉죠.

 

10년전 기억이라 부정확할 순 있어요 ^^

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