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질문 3T3-L1 분화시킨 후, plate에서 뜹니다.
알해답자(대학생)  |  02.25 20:25

오징어 구우면 오징어가 말리듯이 세포가 well 가장자리에서부터 말리면서 결국은  뜨게(peel off)됩니다. 100% confluency일 때, 분화를 유도하였습니다. 또한, cell의 passage는 잘 모르는 상태로 선배가 쓰던걸 이어받아서 썼습니다. 어째서 이러는 것인지 원인을 생각을 해보았는데,

1. 분화유도시기를 잘못 잡았기 때문에, cell이 overgrowth되서 그렇다.

2. cell의 passage가 오래되어 그렇다.

 

이 둘 중 어느 것이라고 생각하시나요 선배님들..

혹시 둘다 아니라고 생각하신다면 그 원인을 저도 좀 알 수 있을까요ㅠㅠ

 

감사합니다 선배님들.

#3T3-L1
 
#분화
 
#peel-off
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  02.25 21:08  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cell passage문제는 분화가 잘되고 안되는 문제에 관련이 더 많고 너무 오래 배양

후 분화한 것이 가장 큰 원인일 듯 합니다.

이 cell 뿐만 아니라 다른 cell 역시 100% confluency에서 실험하면 해당 cell은

이미 apoptosis를 준비하고 있기 때문에 실험이 잘 안됩니다.

60% ~ 70% confluency에서 분화를 시켜 보세요.

알심기일전  |  02.25 21:32  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

SPEED님의 답변에 동의합니다.

 

저도 3T3-L1 실험을 하면서 질문자님과 똑같이 꽤나 애를 먹은 적이 있는데요,

SPEED님의 답변처럼, 100% confluent하다고 판단되기 전 단계 (cell density가 매우 높지만 plate 바닥을 완전히 덮지는 않은 상태), 즉 7-80% confluent 상태에서 분화배지를 조심조심 갈아주었습니다.

다행히도 cell이 6 well 중간 지점까지 말려들어가는 현상은 더 이상 없더군요~!

그리고 분화 유도가 시작된 시점부터는, 모든 파이펫팅을 슬로모션처럼 조심조심 느리게 진행하였습니다. well의 벽 부분으로 쏘아 세기도 조절하였구요.

의문이 조속히 해결되기를 바라는 마음에 몇 자 적습니당ㅎㅎ

알해답자  |  02.25 21:37  

감사합니다 speed선배님.

일전에도 큰 도움받았습니다.

이번에도 정말 제게는 소중한 조언을 주셔서 감사합니다.

오늘 주신 조언에서, 한 가지 궁금한 것이 있습니다.

3T3-L1은 100% confluency를 보여야 분화가 유도된다고 배웠는데, 90%도 아니고 70%에서 분화하라고 말씀해주시는 이유가 있는지 궁금합니다.

 

또 이번 질문과는 관련이 없지만, 분화시킨 후 cell media가 change를 해줄 타임도 아닌데 노랗게 변하는 이유를 혹시 아시나요?

대왕개구리SPEED  |  02.25 22:19  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

모든 cell 실험의 기초는 재료가 되는 cell이 가장 건강한 상태로 시료

처리라든지 목적 실험에 사용되는 것입니다.

동물세포의 여러 특징 중 부착세포의 성장 pattern에 관해서는

single layer growth입니다.

즉 표면으로 자라고 2겹으로는 자라지 않습니다.

따라서 표면 성장 중 이웃 cell의 밀도 또는 빈공간을 cell은 인식합니다.

빈 공간이 거의 남지 않고 주변에 cell 밀도가 너무 많아지면 건강한 상태를

벗어나 세포 사멸 관련 signal pathway가 작동 준비를 합니다.

따라서 실험에 필요한 cell 밀도 및 cell 건강을 만족시키기 위해 90~100% 

confluency는 절대 피하는 것이 좋습니다.

60% ~80% 사이는 연구자 마다 선호하는 confluency를 선택해서 실험하면

됩니다. 

그리고 media color문제는 오염이 아니라면 cell 성장에 따른 변화이기 때문에

media change 시점이 아니라도 change를 해주는 것이 좋습니다.

color 변화는 cell 대사산물로 인한 것이기 때문에 color가 변하고 오랜시간

fresh media로 change하지 않으면 cell에 대한 stress 요인이 됩니다.

하지만 세균이나 효모 오염이 되면 상당히 빠른 시간에 color change가

됩니다.

알해답자  |  02.26 01:23  

이번에도 큰 도움주셔서 감사합니다 speed선배님

항상 건강하시길 바랍니다!!

-  |  02.28 11:45   

분화유도가되고 난 후 지방이 많이 생기면 그렇게 말려 올라가더라구요,

그래서 저희는 분화유도 후, media 색이 많이 변하면 하루에 두번씩 갈아주었습니다. 셀 상태가 엄청 약해졌기 때문에 석션, 분주도 엄청 조심히 해주셔야해요. passage가 오래되면 분화조차 잘 안됩니다.

개구리미네르바  |  03.12 14:26  

3T3-L1 세포가 분화후에 뜨는이유는 세포배양(계대배양) 조건에서 문제가 있어서 발생하는 경우가 많습니다. 특히 세포배양을 100% confluency를 넘겨서 계대배양을 반복한경우 이거나  passage를 너무 오래 가지고 간 경우가 그렇더군요. 이때는 새로운 stock을 풀어서 사용하시는 것을 권장합니다.

그러나 분화실험을 할때는 세포를 seeding후 100% confluency를 만드시고 cell growth arrest (1~2day)를 시키신 후 분화를 유도하시는 것이 adipogenesis에 유리합니다. 

실험전 계대배양시 관리만 잘하시면 분화유도할대 세포가 뜨는일은 잘 일어나지 않습니다.

좋은 결과 있으시길 바랍니다.

 

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