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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 housekeeping gene인 GAPDH가 흔들립니다.
알Chummy(대학원생)  |  02.25 20:13

안녕하세요, western blot를 접한지 얼마 안된 대학원생입니다...

먼저 너무 기초적인 질문이 될 것 같아 죄송합니다.

저는 현재 primary cell에 저산소증을 유발시켜 나오는 HIF-1alpha 를 western을 통해서 검증하는 실험을 하고 있는데요.

다름이 아니라 GAPDH가 흔들리는 결과를 계속해서 얻고 있습니다.
학사 전공이 기초 biology가 아니라 자세히는 모르지만, GAPDH나 Tubulin과 같이 housekeeping gene은 공통적으로 나와야해서 비교 시 reference가 된다고 알고 있습니다.

GAPDH가 완전하게 각 군에 대해서 동일할 수는 없겠지만
Protein을 prep 한 후 동일하게 맞춰준 것을 gel에 각 군에 대해서 동일한 양을 loading 하는데도... 이해할 수 없는 범주에서 GAPDH가 흔들린다는 것입니다.
예를 들어, 저산소증 10분 20분 30분 40분 그룹 이렇게 총 5개의 그룹(컨트롤 포함)이 있다고 했을 때
band volume이 1, 10, 3, 4, 7 이런 식으로 말입니다...

문제가 된다고 생각하는 부분은 몇 가지가 있습니다.
1. 애초에 조직 해리 후 dish에 seeding 하는 양 자체의 confluency가 너무 적은가라는 생각을 했습니다. 저는 1x10^5으로 confocal dish에 seeding합니다. 각 군을 이루는 unit은 6개 정도로 이론적으로 cell을 다 prep 해도 6x10^5 정도 이겠네요.
허나 이 문제는 prep 이후 각 군에 대해서 동일하게 그 양을 맞춰주기 때문에 큰 문제가 된다고 생각하지 않습니다. 사소한 차이겠지요?
만약 GAPDH가 전부다 흐리게 나온다고 한다면 해당 문제를 의심해볼 수 있겠으나, 각 군마다 밴드 볼륨이 너무 다르게 나온다는 점입니다.

2. 저산소증 유발 실험을 해보신 분들은 알겠지만... 저산소증에 노출된 primary cell 의 media를 갈고 media의 페놀 레드가 포함된 것이 neuron protein extraction buffer에 영향을 미친다는 가이드라인이 있어 PBS와 같은 것으로 한번 washing 해줍니다. 이때 cell이 많이 떨어져 나갑니다... 1번의 연장선상으로 안그래도 confluency가 적은데 이러한 washing 과정에도 prep 할 수 있는 cell 양이 적어들어서 그런건지...

정리하자면, protein prep 이후 그 양을 맞춰주는데도 불구하고 GAPDH가 흔들리는 data를 얻는다는 것이고, sample은 rat의 hippocampus와 cortical cell입니다...

비슷한 경험이 있으신 선배님들의 의견을 듣고 싶고, 혹시 제가 참고할 수 있는 논문이 있다면 알려주시면 찾아서 공부하도록 하겠습니다.

감사합니다.

#western blot
 
#GAPDH
 
#housekeeping gene
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대왕개구리안재진  |  02.26 09:12  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

같은 실험을 진행하지는 않았습니다. 

1. 그러나 이번 실험만 loading control이 차이가 나는것인가요? 아니면 다른 실험에서도 차이가 나는가부터 따져가야 할것 같습니다.

2. 여러 실험군의 prep을 젤을 걸지 말고 한가지 실험군만 예를들어 비처리 control 같은 시료만 8개 웰에 동량 걸어서 밴드의 두께를 확인해 보세요.

여기서 흔들린다면 이는 실험상 문제가 아니라 젤을 내리는 작업부터 흔드리며 이부분이 잡어야 할것입니다.

3. 실험을 진행할때는 SDS-PAGE를 따로 한장 더 걸어 염색을 진행해보세요. 쿠마시 블루가 염색된 샘플들이 차이가 난다면 그 뒤에 웨스턴에서는 당연히 차이가 나겠죠.

4. 셀이 떨어져 나가도 정량을 진행하지 않나요? 만약 페놀레드가 문제라면 페놀레드 프리 배지를 이용하는건 어떨까요?

마지막으로 loading control을 맞추는건 기본이지만 쉽지만은 않습니다. 시료준비, 단백질 정량, 젤 로딩, 트랜스퍼 등 모든 스텝이 최적화 되어 있을때 비슷한 밴드를 얻을수 있거든요. 

약간 시간이 걸리더라도 하나하나 스텝을 점검하시는 기회를 가지면 좋은 결과가 나올것입니다. 

알Chummy  |  02.26 10:48  

안재진 선배님,

우선 답변에 감사드립니다.

1.  해당 GAPDH가 흔들리는 실험이 있고 나서는 rat의 다른 조직 및 기관을 갈아서 GAPDH를 내려보는 실험을 했던 적이 있습니다. Western 자체의 protocol 문제인가 하여 진행해보았는데 다른 조직(뇌 전체, 폐, 비장 등)에 대해서는 GAPDH가 맞았습니다.

2-3. 비처리 군에 대해서 동일한 양을 걸어 밴드를 확인해보는 것이 현재로서는 가장 좋은 trouble shooting이 될 것 같습니다.. 한번 실험 후 또 문제가 있으면 다시 업데이트 해보도록 하겠습니다.

4. 선배님 말씀대로 페놀레드가 문제가 된다면 프리 배지를 사용하거나 아니면 washing으로도 충분히 해결되는 것이기 때문에 고민할 필요가 없다고 생각합니다. 또 prep 이후에 동일한 양을 맞춰주기 때문에 더욱 더 고민할 문제는 아니지요.

 

다시 한번 친절한 답변에 감사드립니다.

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