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pI값과 관계없이 Native PAGE protocol은 정해져 있습니다.
전기영동 시 단백질이 분자량이 아니라 pI에 따라 내려가는 pattern이 달라집니다.
그리고 전기영동은 분자 단위로 분리하는 실험방법이기 때문에 바이러스
자체는 내려가지 않고 분리 자체도 안됩니다.
바이러스 capsid를 1차 분리하고 전기영동하면 capsid 단위 단백질의 전기영동이
가능합니다.
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레벨2
Weierstrass
(대학생)
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20.02.21 18:13
네 ㅎㅎ 바이러스 내렸을때 구조단백질 각각으로 나오지 않고 바이러스 비리온 그대로여야만 해서요!
실험법을 선택하고 진행하는 절차는 다음과 같습니다.
1. 실험을 하기 전에 분석하고자 하는 분석 대상을 정한다.
2. 분석 대상을 분석하는데 가장 적합한 방법을 선택한다.
3. 분석 대상을 분석하는데 가장 적합한 분석 조건을 선정한다.
4. 선택한 분석방법을 사용하여 적합한 분석 조건에서 분석 대상을 분석한다.
PAGE는 어떠한 물질(단백질, 펩타이드, 핵산 단편 등)을 크기에 따라 분리, 분석하는 방법으로, 실험 조건에 물질을 변성시키는 조건 (SDS, beta-mercaptoethanol, 등)을 포함하면 Non-Native PAGE, 변성 조건이 아닌 경우 Native-PAGE라 부른다. Polyacrylamide는 두가지 성분 (acrylamide, bis-acrylamide)으로 만드는데 두성분의 농도와 비율에 따라 만들어지는 pore의 크기가 달라지며, polyacrylamide로 분석할 수 있는 분자량의 범위는 수천 Da~수백 kDa으로 다양하다.
Virion은 생물과 무생물의 중간 개념으로 가장 작은 생물과 무생물의 경계선에 있는 것이긴 하지만, 핵산과 많은 capsid 단백질로 이루어져 있는 거대 분자로 PAGE로는 분리 분석할 수 없다. Virion 자체를 분리하고자 한다면 PAGE가 아니라 virion을 흡착하는 column chromatography를 사용하거나 초원심분리와 같은 방법을 사용하여야 한다.
Virion의 구성 성분인 capsid 단백질을 native한 조건에서 분리하고자 한다면, native PAGE로 분리가 가능하다. 단, native PAGE 시약에는 non-native PAGE와 같이 단백질 전체를 코팅하여 (-)charge를 띠게 하는 SDS가 포함되어 있지 않으므로 전기영동 조건의 pH에서 (-) charge를 띠어야 한다. 그럴러면, 단백질의 pI 값이 전기영동 buffer의 pH보다 낮아야 한다. 왜냐하면 전기영동 조건 (pI 값보다 알칼리 조건)에서 수소이온을 잃고 (-) charge를 띠게 되기 때문이다.