눈으로 잘붙어 있는 것처럼 보이는 plate를 바로 mild하게 shaking해보세요.
잘 붙어있으면 mild한 shaking에서 떨어지지 않습니다.
사용세포와 well plate 종류는 어떻게되나요?
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레벨2
애리닝
(일반인)
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20.02.20 18:00
3t3 mouse cell 사용하였고 24well plate에 seeding 하였습니다.!
plate maker를 물어본 거였구요..
stock해놓은 cell을 풀어서 한번 해보세요.
정상 3T3 cell line이면 엄청 강하게 잘 붙는 cell입니다.
아 뭉치는 거는요 미디아 볼륨 문제 예요 각 웰마다 적당한 볼륨을 넣으셔야 하는데요
바깥쪽으로 몰리는 현상은 셀 심을때 너무 볼륨이 작아서.. 미디아가.. 벽쪽에 끌리면서.. 셀들도.. 그쪽으로 몰립니다.
셀 파이펫팅 잘해주시고.. 심을 때 볼륨 첵업 해보세요..
(또 너무 많이 너으면.. 가운데 몰림 현상이 되니.. 조심하세요 )
근데 MTT 를 24 웰 쓰시는 이유가 있으신가요 ? (오지랖 오지랖)
96 웰.. 이 관리도 편하고..가성비 좋구.. 데이타도 잘나오는것 같아서요
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흠....
(비회원)
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20.02.21 00:26
일단 3t3는 관리하기 어려운 세포죠... 물론 잘 자라는 것만 보고 관리하기 쉽다고 하기도 하지만 3t3로 실험 해본 사람이라면 이렇게 지랄맞은 세포가 있나 싶을정도로 귀찮습니다. plate에서 잘 떨어지고 분화도 잘됐다가 안됐다가.... 다년간 경험으로 볼떄 FBS 및 세포 confluence 문제입니다...ATCC 3T3-L1 설명서를 보시면
Note: The serum used is important in culturing this line. Calf serum is recommended and not fetal bovine serum. The calf serum initially employed and found to be satisfactory was from the Colorado Serum Co.
라고 적혀 있습니다. FBS에는 많은 분화를 촉진 혹은 세포를 자극하는 물질이 calf serum 보다 많이 들어있기 때문에 3t3의 세포 배양에 있어서 좋지 않습니다. FBS가 sponteneous differentiation을 일으킨다는 연구들도 있습니다. 즉 FBS 에서 배양되면 스스로 어느정도 분화하여 세포가 변화하게 됩니다. 이렇게 되면 분화도 잘 되지 않고 세포의 부착능력도 현저히 떨어집니다. 아마 세포가 변성된거 같습니다. 3T3도 다른 세포가 마찬가지로 confluence가 되지 않게 관리하는 것도 무척 중요합니다. 이 두가지만 잘지키신다면 좋은 결과 얻을수 있습니다. 그리고 세포자체가 잘 떨어지기 떄문에 MTT보다는 96well 사용하시고 MTS, WTS등 DMSO 필요 없는 시약 사용하세요~셀 시딩후 약물 처리후 solution 넣고 인큐베이션 시키면 실험 끝입니다.
잘붙어있는거 확인하고 treat 없이 media change를 하면 cell이 떨어진건지 동그랗게 변함.
> media change할 때, 한 well씩 media suction하고 바로 media를 넣어주나요? 아니면 모든 well을 한꺼번에 media suction하고, media를 넣어주나요?
media change를 할 때, cell이 동그랗게 되는 원인 중의 하나는 공기 노출 시간이 길어서입니다.
한 well씩 배지를 교환해보세요. 이때에는 aspiration/suction system보다는 1ml micropipettor를 사용하여 배지를 버리고, 배지를 넣고 하는 방법으로 한 well씩 배지를 교환해보는 것이 좋을 것 같습니다.
- MTT 시약 처리전 다시 한번 현미경으로 관찰하면 아예 떨어져서 동그랗게 된 cell이 많아짐.
>이런 경우에는 complete media에서 MTT 시약으로 완전히 바뀌었기 때문에 cell에 shock이 간 것으로 보입니다.
그래서 일반적으로는 media change 없이 10x의 고농도 MTT를 배양하고 있는 well에 직접 넣는 방법을 많이 사용하는 것 같습니다.
1. 일단은 사용 중인 MTT 시약을 녹인 용매를 확인해보세요. DMSO 등의 유기용매라고 하면 일반적으로는 working concentration이 < 0.1% DMSO 정도 되게 stock을 만드는 것 같습니다.
2. PBS buffer이면, 실험자가 배양에 사용하는 배지의 FBS % 조성대로 FBS를 추가해서 넣어보세요.
3. 1의 경우에도 FBS를 추가로 넣어보세요. 이 수준의 MTT 농도 변화는 색깔 변화에 크게 영향받지 않을 것 같습니다.
현미경을 동해 보면 well의 왼쪽에 cell이 뭉쳐있는듯한 모습이 보이는데, seeding후 palte를 좌우 위아래로 잘흔들어주고 넣는데 왜 자꾸 뭉치는지 모르겠어요 incubator에 넣을때도 최대한 조심조심 넣는데 말이죠 ㅠㅠ
1. cell이 한쪽으로 뭉쳐있는 것은 seeding 후 많이 흔들어주어서 cell이 well 가장자리로 밀려난 것 같습니다. seeding 할 때 well 바닥에 골고루 넣어주고, 한번 무심하게 흔들어주고, cell이 대충 바닥으로 가라앉을 때까지 1, 2분 정도쯤 그냥 두는 것도 좋을 것 같습니다.
2. 24 well plate에 있는 세포들만 뭉칩니까? 아니면 maintain하고 있는 dish/flask에 있는 세포들도 뭉칩니까?
2-1. 둘다라면, cell을 harvest할 때의 문제일 수 있을 것 같습니다.
2-2. 24 well plate에 있는 세포들만 뭉친다면, seeding할 세포의 양을 넉넉하게 만든 뒤, seeding하고 남은 cell들을 culture dish나 T flask에도 seeding해서 동시에 배양해서 비교해보세요.
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레벨2
애리닝
(일반인)
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20.03.11 16:34
한줄씩 suction하고 media 분주하니깐 mtt 성공했어요
제가 천천히 cell에 영향안가게 파이펫팅 하는데만 집중해서 분주가 넘 느렸나봐요
이런 간단한 과정때매 몇달을 고생했네요 ㅠㅠ 정말 감사드려요