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질문 p-p65의 confocal vs WB negative control 결과가 반대일때
알정야(대학원생)  |  02.19 16:13
안녕하세요,

현재 Raw264.7 cell에 LPS 처리를 해서 antagonist의 효과를 보는 실험 중에 있습니다

Whole cell lysate로 WB를 했을때 negative control에서 p-p65의 발현량이 좀 높게 나오고 있습니다 반복 실험을 해도 같은 결과가 나오고 있는데 단순히 basal level이라기엔 PP65 발현이 너무 높습니다 ㅜㅜ

진짜 문제는 confocal을 했을 때 negative control에서 p-p65의 fluorescence가 나오지 않고 있다는 점입니다.

같은 cell에 같은 조건으로 진행한 두 실험의 결과가 상반되어 설명이 되지 않고 있는데, 이에 관련하여 고수님들의 조언부탁드립니다

단순히 Raw264.7 이 activation되었다고밖에 볼 수 없나요?

Cell은 high glucose DMEM media에 10% FBS 1% P/S에서 키우고 있습니다.

Density도 WB seeding시 1 x 10⁶이라 크게 stress 줄만한 density도 아니라고 보고 있습니다.

감사합니다
#WB
 
#ICC
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
신경  |  02.21 13:28   

Naive / LPS / LPS+antagonist 3그룹에서 P65 , pP65차이 확인을 해야만 밴드가 나온 의미 해석이 가능할거 같네요. 세포의 종류마다 다르지만 NFKB는 여러신호를 받아 자발적으로 일어나는걸로 알고있습니다. 사이토졸/핵 나누어서 핵단백질에서 P65 비교해볼 필요도 있을거 같습니다.

알정야  |  02.26 20:13  
답변 감사합니다 선생님
말씀하신 것처럼 cytosol/nucleus 나눠서 extraction 진행했는데 그래도 IkBa에서만 패턴이 나오고 p65는 또 negative control에서 발현이 되길래 답답해서 글 올려본건데 제 결과와 선생님 조언을 합쳐서 생각하면 역시 cell 상태에 문제가 있거나 extraction 과정에서 cell에 stress를 준 것 같습니다.... 귀한 시간 내서 답변주셔서 다시 한번 감사드립니다.
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